Essai de liaison à la compétition pour étudier les partenaires protéiques concurrents de liaison à la GTPase

Les

protéines de liaison aux nucléotides de la guanine – une catégorie de GTPases – fonctionnent comme un interrupteur moléculaire, alternant entre une forme active liée au GTP et une forme inactive liée au GDP.

Les GTPases actives se lient à des partenaires protéiques spécifiques. Ces partenaires se disputent le même site de liaison sur les GTPases.

Pour étudier la liaison compétitive, commencez par prendre une suspension de GTPase liée à GTP immobilisée sur des billes magnétiques. Ajoutez le premier partenaire d’interaction - la protéine A marquée par fluorescence. Incuber sous agitation pour maintenir les billes en suspension. La protéine A se lie et sature les sites de liaison sur toutes les molécules de GTPase.

Répartissez cette solution de manière égale en plusieurs tubes. Ajoutez un deuxième partenaire d’interaction – la protéine B marquée par fluorescence – aux tubes en quantités croissantes. Incuber sous agitation.

La protéine B se lie au même site de liaison sur les GTPases, déplaçant ainsi la protéine A.

Exposez les tubes à un champ magnétique pour recueillir les billes d’un côté. Jetez le surnageant pour éliminer les protéines non liées. Remettre en suspension les billes complexes protéiques dans un tampon approprié, et quantifier les protéines liées.

Tracez les intensités relatives des protéines A et B liées à la GTPase à chaque concentration de protéine B.

La protéine B atteint un équilibre – occupant les sites de liaison de la moitié des molécules de GTPase – à une concentration relativement plus faible que la protéine A, ce qui indique la plus grande affinité de la protéine B pour la GTPase.

Pour effectuer la reliure de compétition, installez six tubes de microfuge contenant chacun 200 microlitres de tampon de reliure de compétition. Chaque tube doit également contenir 10 microlitres de billes Rac1 chargées de nucléotides et cinq microlitres de la protéine A de liaison Rac1 en tant que protéine de liaison constante.

Dans chaque tube, ajoutez 0, 1, 2,5, 5, 10 ou 20 microlitres de protéine B de liaison à Rac1 en tant que protéine de liaison variable. Ces volumes supposent des concentrations de stock à peu près égales de protéines de liaison constantes et variables et peuvent devoir être ajustés.

Porter le volume total du mélange de liaison à 235 microlitres par l’ajout du tampon de liant de compétition. Ensuite, installez un tube à microfuge contenant 200 microlitres de tampon de compétition, 10 microlitres de billes expérimentales de Rac1 chargées de nucléotides et 10 microlitres de protéine A de liaison à Rac1.

Ensuite, configurez les tubes de contrôle GDP, GTPγS et sans nucléotide comme décrit dans le protocole texte. Incuber les tubes pendant deux heures, en mélangeant par inversion à 4 degrés Celsius. Après l’incubation, lavez les billes trois fois avec le tampon de liaison.

Enfin, éluez les protéines liées dans 20 microlitres de tampon d’échantillon réducteur.