Microscopie à feuillet de lumière sur réseau pour visualiser les interactions récepteur-ligand dans les cellules vivantes

La microscopie à feuillet de lumière sur treillis, LLSM, permet de visualiser les interactions récepteur-ligand à la surface cellulaire dans des cellules vivantes avec une résolution spatio-temporelle élevée.

Prenez une lamelle contenant des cellules exprimant des ligands transduits émettant une fluorescence rouge. Fixez la lamelle côté cellule vers le haut sur un porte-échantillon graissé. Fixez le support sur le piézo d’une platine de microscope pour permettre un positionnement et un balayage précis de l’échantillon pendant l’imagerie. Ajustez les paramètres du logiciel pour vous concentrer sur une seule cellule exprimant un ligand.

Pipetez la suspension cellulaire exprimant le récepteur sur la lamelle. Les récepteurs sont marqués avec des anticorps verts marqués au fluorophore. Imagez les paires de cellules en interaction.

Le laser d’excitation du microscope émet un faisceau laser circulaire à polarisation linéaire qui passe à travers des lentilles cylindriques pour créer une feuille de lumière. La feuille de lumière est projetée sur un modulateur qui élimine l’excès de diffraction et le transforme en un motif en réseau ultrafin.

La feuille lumineuse en réseau illumine une section ultramince de la paire de cellules en interaction, et la fluorescence émise par les cellules en interaction est capturée perpendiculairement au faisceau incident. Imagez la paire de cellules en interaction dans plusieurs plans Z et capturez des images bidimensionnelles dans chaque plan focal avec une caméra haute vitesse.

À l’aide d’un logiciel approprié, combinez ces images pour former une pile z - une image quadridimensionnelle à haute résolution démontrant la dynamique spatio-temporelle de l’interaction récepteur-ligand à la surface de la cellule.

Ajoutez 10 millilitres d’eau et 30 microlitres de fluorescéine dans le bain LLSM. Tout d’abord, appuyez sur Image (Accueil) pour déplacer l’objet en position d’image, et regardez un motif de faisceau laser à un seul vaisseau.

Alignez le faisceau laser à l’aide du guide et de la région d’intérêt prédéfinie pour faire du faisceau un motif mince équilibré dans toutes les directions. Le faisceau doit également apparaître focalisé dans l’appareil photo du viseur. Utilisez les deux dispositifs de réglage de l’inclinaison du miroir, le micromètre de mise au point supérieur et la couleur de l’objectif pour régler le faisceau.

Ensuite, lavez le bain et les objectifs avec au moins 200 millilitres d’eau pour éliminer complètement toute fluorescéine.

Pour imager des billes fluorescentes standard, activez l’option Tramage en la réglant sur 3 dans la zone « Plage X Galvo » et appuyez sur Live pour afficher le champ actuel. Ajustez manuellement le miroir inclinable, la couleur de l’objectif et le micromètre de mise au point pour obtenir les valeurs de gris les plus élevées. Ensuite, ajustez si nécessaire pour obtenir les modèles appropriés pour les modes de balayage objectif, Z galvo, Z plus objectif et balayage d’échantillon. Après cela, appuyez sur Exécuter en mode de balayage d’échantillon pour récupérer la fonction d’étalement du point d’échantillonnage pour la désinclinaison et la déconvolution. Passez les lasers en mode tricolore et appuyez à nouveau sur Exécuter.

Pour commencer, ajoutez 100 000 cellules présentatrices d’antigène à la lamelle circulaire préparée de 5 millimètres de diamètre et laissez-les reposer pendant 10 minutes. Graissez le porte-échantillon et ajoutez-y la lamelle côté cellule vers le haut.

Ensuite, ajoutez une goutte de support d’imagerie à l’arrière de la lamelle. Vissez le porte-échantillon sur le piézo et appuyez sur Image (Accueil). Trouvez une cellule présentatrice d’antigène à imager et assurez-vous que le LLSM et le logiciel d’imagerie fonctionnent correctement.

Appuyez sur Live pour afficher l’image actuelle. Déplacez-vous le long de Z pour trouver la lamelle et les cellules. Trouvez le centre d’une cellule présentatrice d’antigène en vous déplaçant dans la direction Z, puis appuyez sur Stop pour mettre le laser en pause. Vérifiez 3D et saisissez les paramètres souhaités. Appuyez sur Entrée, puis sur Exécuter pour collecter les données.

Abaissez l’étage en position de charge et ajoutez 50 microlitres de lymphocytes T dans le support d’imagerie goutte à goutte, directement sur la lamelle. Il est préférable de laisser une goutte se former à l’extrémité de l’embout de la pipette, puis de toucher l’embout au liquide du bain. Relevez la scène en cliquant sur Image (Retour).

Commencez l’imagerie. Assurez-vous de définir la pile Z et la durée du timelapse souhaitées. Par exemple, imaginez 60 piles Z à une taille de pas de 0,4 micromètre et entrez des images temporelles du 500e. Arrêtez l’enregistrement avant d’atteindre 500 images pour éviter le photoblanchiment. Utilisez le mode Live pour rechercher des paires de cellules, et lorsque les paramètres prêts et souhaités ont été saisis, appuyez sur Exécuter pour collecter des données.