Microscopie à fond noir pour visualiser la dynamique de diffusion de nanobâtonnets sur la membrane cellulaire

Pour étudier la dynamique de diffusion des nanotiges d’or sur une membrane de cellules vivantes à l’aide de la microscopie à fond noir, la DFM, combinée au suivi de particules uniques, commence par une lamelle stérilisée dans une boîte de culture contenant un milieu approprié. Ajoutez la suspension cellulaire sur la lamelle. Le milieu facilite la croissance cellulaire.

Incuber avec des nanotiges d’or chargées positivement qui s’adsorbent sur la membrane cellulaire chargée négativement via des interactions électrostatiques. Pipetez le support du plat jusqu’au sillon d’une lame de verre. Placez la lamelle côté cellulaire vers le bas sur la rainure et scellez.

Placez la lame sur la platine du microscope à fond noir. Le microscope éclaire l’échantillon avec une lumière oblique à angle élevé passant à travers un condenseur à fond noir spécialisé.

Lors de l’illumination des nanobâtonnets, les électrons libres à la surface des nanobâtonnets oscillent à une fréquence résonnant avec la lumière incidente. Les électrons oscillants diffusent la lumière à une longueur d’onde spécifique capturée par la lentille de l’objectif, ce qui permet de visualiser les nanotiges.

De même, la membrane cellulaire – composée de lipides et de protéines – diffuse la lumière incidente à un indice de réfraction plus élevé que le milieu environnant, créant une image lumineuse sur un fond sombre. Capturez des images DFM de séries chronologiques.

À l’aide d’un logiciel approprié, effectuez une analyse de suivi de particules uniques sur les images DFM pour visualiser la diffusion des nanobâtonnets à travers la membrane cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée.

Commencez par brûler une lamelle en verre trempée dans de l’éthanol sur la flamme et placez la lamelle dans une boîte de culture cellulaire de 35 x 10 millimètres contenant 2 millilitres de milieu de culture cellulaire sans rouge de phénol. Ajoutez 50 microlitres de la suspension cellulaire d’intérêt sur la lamelle et secouez doucement la coupelle d’avant en arrière et de gauche à droite pour répartir uniformément les cellules.

Placez la boîte dans l’incubateur de culture cellulaire pendant environ 12 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 20 % à 40 % avant d’ajouter 20 microlitres de nanotiges d’or recouvertes de CTAB dans la boîte. Après avoir secoué doucement pour disperser uniformément les nanotiges dans le plat, placez le plat dans une atmosphère humidifiée pendant 5 minutes.

À la fin de l’incubation, transférez lentement 100 microlitres de surnageant de la boîte dans la rainure d’une lame de verre, et placez soigneusement la lamelle côté cellule vers le bas sur la rainure de la lame. Ensuite, scellez le bord de la lamelle avec du vernis à ongles et laissez sécher le vernis à ongles avant de placer la lame sur la platine du microscope à fond noir.

Pour le suivi d’une seule particule par microscopie à fond noir, placez une goutte d’huile sur le condenseur à fond noir immergé dans l’huile et tournez le bouton jusqu’à ce que le condenseur entre en contact avec la lame de verre. Placez une goutte d’huile sur le dessus de la vitre de protection et tournez le bouton de mise au point jusqu’à ce que l’objectif à immersion dans l’huile 60x touche l’huile.

Allumez la source lumineuse et tournez légèrement le bouton de mise au point pour faire la mise au point sur le plan d’imagerie. Ensuite, cliquez sur l’icône de la caméra dans le logiciel du microscope pour enregistrer une série chronologique d’images de diffusion de la lumière à l’aide de la caméra CMOS couleur et enregistrez l’image au format TIFF.

Pour extraire une seule trajectoire à long terme, ouvrez l’image dans ImageJ et cliquez sur Image | Type | et 8 bits pour convertir l’image du mode RVB au mode 8 bits. Pour régler le contraste, cliquez sur Image | Ajuster | Luminosité | Contraste, puis définissez les paramètres. Sélectionnez une particule cible et utilisez « Ctrl + X » pour couper l’arrière-plan de la série chronologique.

Cliquez sur Plug-ins | Particle Tracker Classic | et Particle Tracker pour ouvrir la fenêtre de détection de particules et de liaison de particules et définir le rayon sur 6, la limite sur 0 et le centile sur 0,01 %. Réglez la plage de liaison sur 10 et le déplacement sur 10, puis cliquez sur « OK » pour ouvrir la fenêtre des résultats du traqueur de particules et voir les résultats.

Cliquez sur « Visualiser toutes les trajectoires » pour inspecter les trajectoires générées. Si la trajectoire générée par le logiciel et la trajectoire mobile des nanotiges d’or correspondent, cliquez sur « Enregistrer le rapport complet » pour enregistrer les résultats. Si la trajectoire générée par le logiciel ne correspond pas à la trajectoire mobile des nanotiges d’or, cliquez sur « Relink Particles » pour relier à nouveau les particules détectées avec des paramètres de plage de liaison et de percentile différents.