Microscopie à force atomique à intervalle rapide pour capturer la dynamique des nucléosomes

Les nucléosomes – des unités répétitives d’ADN eucaryote – sont constitués de segments d’ADN enroulés autour de noyaux de protéines d’histones. Le déballage de l’ADN autour du noyau d’histones est crucial pour la dynamique des nucléosomes.

Pour capturer la dynamique des nucléosomes, commencez par un substrat de mica lisse et fonctionnalisé monté sur un microscope à force atomique, AFM, une platine de scanner. Recouvrir le substrat d’un tampon contenant des nucléosomes.

L’ADN nucléosomique chargé négativement interagit avec les charges positives sur le mica fonctionnalisé, les immobilisant à la surface. Lavez le substrat de mica immobilisé avec un tampon pour éviter l’encombrement des nucléosomes.

Transférez l’étage du scanner contenant des nucléosomes dans une chambre d’imagerie contenant un cantilever pré-monté, avec une pointe sur le bord et tournée vers le haut vers les nucléosomes.

Remplissez la chambre avec un tampon d’imagerie. Alignez le faisceau laser sur le dos du porte-à-faux pour assurer des mesures de déflexion précises.

L’extrémité AFM oscille près des nucléosomes entièrement enveloppés et balaye la surface pour mesurer la hauteur des nucléosomes à intervalles réguliers.

Le déballage spontané de l’ADN augmente la hauteur des nucléosomes, alternant les oscillations de la pointe et conduisant à une déviation en porte-à-faux. Cette déviation en porte-à-faux décale la position du faisceau laser réfléchi, qui est détecté par un détecteur sensible à la position et produit des images topographiques des nucléosomes.

Sur les images AFM, le noyau des histones apparaît sous la forme d’une tache lumineuse avec de l’ADN non enveloppé de hauteurs croissantes au fil du temps, ce qui indique la dynamique des nucléosomes.

Utilisez de la colle pour scanner de tige de verre pour fixer une tige de verre à la platine du scanner AFM. Laissez sécher pendant au moins 10 minutes. Pendant ce temps, faites des morceaux circulaires de mica de 0,1 millimètre d’épaisseur avec un diamètre de 1,5 millimètre en les perforant dans une feuille de mica plus grande. Utilisez la colle à tige de mica-verre à grande vitesse AFM pour fixer ce morceau de mica à la tige de verre sur l’AFM à grande vitesse, et laissez-le rester intact pendant au moins 10 minutes pendant qu’il sèche.

Ensuite, clivez les couches du mica à l’aide d’un ruban sensible à la pression jusqu’à ce qu’une couche bien clivée soit visible sur le ruban. Ensuite, diluez 1 microlitre de stock APS de 50 millimolaires dans 99 microlitres d’eau distillée désionisée pour obtenir une solution APS de 500 micromolaires. Déposez 2,5 microlitres de la solution sur la surface du mica fraîchement clivé et laissez la surface se fonctionnaliser pendant 30 minutes.

Après l’incubation, rincez le mica plusieurs fois avec de l’eau déminéralisée distillée en appliquant des rinçages de 3 microlitres. Retirez complètement l’eau après chaque rinçage en plaçant une lingette non tissée sur le bord du mica. Après le rinçage final, placez 3 microlitres d’eau distillée déminéralisée sur la surface et laissez-le reposer pendant au moins 5 minutes pour éliminer tout APS non spécifiquement lié.

Ensuite, placez la sonde dans le support AFM à grande vitesse et positionnez le support sur l’étage AFM avec la pointe vers le haut. Rincez le support à l’aide de 100 microlitres d’eau distillée déminéralisée, suivi de deux rinçages de 100 microlitres de tampon d’imagerie de nucléosomes filtré de 0,22 micron. Une fois les rinçages terminés, remplissez la chambre avec 100 microlitres de tampon d’imagerie de nucléosomes, en immergeant l’extrémité.

Ajustez la position du porte-à-faux jusqu’à ce qu’il soit touché par le laser. Ensuite, rincez le mica APS cinq fois avec un tampon d’imagerie de nucléosomes filtré, en utilisant 4 microlitres par rinçage. Diluer 1 microlitre de stock d’assemblage de nucléosomes dans 250 microlitres de tampon d’imagerie de nucléosomes filtré pour une concentration finale de nucléosomes de 1 nanomolaire.

Déposez 2,5 microlitres de cette dilution sur la surface et laissez-le reposer pendant 2 minutes. Rincez la surface deux fois avec 4 microlitres de tampon d’imagerie de nucléosomes pour éviter l’encombrement. Après le rinçage final, laissez la surface recouverte d’un tampon d’imagerie. Placez le scanner et l’échantillon sur le dessus du porte-pointe de manière à ce que l’échantillon soit face vers le bas.

Pour commencer l’approche, utilisez la fonction d’approche automatique avec une amplitude de point de consigne proche de l’amplitude de l’oscillation libre. Ajustez le point de consigne jusqu’à ce que la surface soit bien suivie. Ensuite, réglez la zone de l’image autour de 150 par 150 nanomètres à 200 par 200 nanomètres avec un taux d’acquisition de données d’environ 300 millisecondes par image d’imagerie.