Microscopie d’immunofluorescence pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN

Pour visualiser des protéines spécifiques de réponse aux dommages de l’ADN sur les sites de cassure double brin de l’ADN, DSB, à l’aide de la microscopie d’immunofluorescence, commencez par des lames de microscope contenant des monocouches de cellules mononucléées humaines avec des DSB. Fixez les cellules avec du paraformaldéhyde.

Traiter avec un détergent non ionique, des membranes perméabilisantes pour accéder aux cibles intracellulaires. Ajoutez une solution bloquante contenant des protéines, bloquant les sites de liaison non spécifiques des cellules. Incuber avec des anticorps primaires qui se lient aux protéines de réponse cibles.

Traiter avec un mélange d’anticorps secondaires marqué avec différents fluorophores pour se lier spécifiquement à leurs anticorps primaires respectifs attachés aux protéines. Teinture d’ADN avec DAPI. Ajouter un support de montage ; Montez la lamelle.

Lors de la microscopie à fluorescence, le faisceau de lumière incidente atteint le filtre d’excitation, laissant passer la lumière d’une longueur d’onde d’excitation spécifique. Lorsqu’elle atteint le miroir dichroïque – un séparateur de faisceau – la lumière d’excitation se réfléchit sélectivement vers