Microscopie d’immunofluorescence pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN

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Techniques biologiques

0 vues • 5:23 min • July 8th, 2025

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Pour visualiser des protéines spécifiques de réponse aux dommages de l’ADN sur les sites de cassure double brin de l’ADN, DSB, à l’aide de la microscopie d’immunofluorescence, commencez par des lames de microscope contenant des monocouches de cellules mononucléées humaines avec des DSB. Fixez les cellules avec du paraformaldéhyde.

Traiter avec un détergent non ionique, des membranes perméabilisantes pour accéder aux cibles intracellulaires. Ajoutez une solution bloquante contenant des protéines, bloquant les sites de liaison non spécifiques des cellules. Incuber avec des anticorps primaires qui se lient aux protéines de réponse cibles.

Traiter avec un mélange d’anticorps secondaires marqué avec différents fluorophores pour se lier spécifiquement à leurs anticorps primaires respectifs attachés aux protéines. Teinture d’ADN avec DAPI. Ajouter un support de montage ; Montez la lamelle.

Lors de la microscopie à fluorescence, le faisceau de lumière incidente atteint le filtre d’excitation, laissant passer la lumière d’une longueur d’onde d’excitation spécifique. Lorsqu’elle atteint le miroir dichroïque – un séparateur de faisceau – la lumière d’excitation se réfléchit sélectivement vers la lentille de l’objectif, qui concentre la lumière sur l’échantillon.

La lumière d’excitation incidente excite les électrons du fluorophore à un état d’énergie plus élevé. En revenant à l’état fondamental, les électrons émettent de la lumière à une longueur d’onde plus longue, collectée par la lentille de l’objectif et retransmise au miroir dichroïque.

Le miroir permet à la lumière de fluorescence émise de passer à travers le filtre d’émission, ce qui permet uniquement à la lumière de fluorescence souhaitée d’atteindre le détecteur. Traitez les images. Analysez les différents foyers fluorescents colorés pour visualiser la co-localisation des protéines de réponse aux dommages de l’ADN sur le site DSB.

Préparer deux cytospins avec des cellules mononucléées des échantillons du patient par centrifugation de 1 x 105 cellules pour chaque préparation. Fixez les cellules avec 200 microlitres de PFA à 4 % pendant 10 minutes.

Après la fixation, lavez doucement les cellules trois fois avec 30 millilitres de PBS pendant cinq minutes chacune sur un agitateur. Ensuite, perméabilisez les cellules avec 200 microlitres d’Octoxinol-9 à 0,1 % pendant 10 minutes. Lavez doucement les cellules trois fois avec 30 millilitres de solution bloquante à 5 % pendant cinq minutes chacune sur un agitateur de laboratoire. Bloquez les cellules dans 30 millilitres de solution de blocage fraîche à 5 % pendant une heure.

La fixation et la perméabilisation des cellules avec 4 % de paraformaldéhyde et 0,1 % d’octoxinol-9 ont préservé distinctement les foyers gamma H2AX et 53BP1.

Incuber une préparation des cellules avec un anticorps monoclonal anti-gamma H2AX de souris et l’autre préparation des cellules avec un anticorps monoclonal anti-gamma H2AX de souris et un anticorps polyclonal de lapin anti-53BP1 pendant une nuit à 4 degrés Celsius.

L’utilisation d’anticorps anti-gamma H2AX et anti-53BP1 éprouvés est fortement recommandée.

Après l’incubation, lavez doucement les cellules trois fois avec 30 millilitres de solution bloquante à 2 % toutes les cinq minutes sur un agitateur de laboratoire.

Ensuite, incubez la première préparation des cellules avec un anticorps secondaire anti-souris de chèvre conjugué à Alexa488 dilué 1 sur 500 dans une solution bloquante à 2 %. Incuber la deuxième préparation des cellules avec un anticorps secondaire anti-souris chèvre conjugué à Alexa488 et un anticorps secondaire anti-lapin âne conjugué à Alexa555 dilué 1 sur 500 dans une solution bloquante à 2 %.

Lavez doucement les cellules trois fois avec 30 millilitres de PBS sur un agitateur de laboratoire. Retirez le PBS et montez les cellules avec un support de montage. Avec précaution, placez une lamelle sur le support de montage, afin qu’aucune bulle d’air ne s’incruste. Attendez au moins trois heures que le milieu de montage durcisse avant d’analyser les cellules par microscopie à fluorescence.

Enfin, analysez les foyers gamma H2AX et 53BP1 dans les noyaux cellulaires avec un microscope à fluorescence équipé de filtres pour DAPI, Alexa488 et Cy3 lors de l’imagerie à un grossissement d’objectif de 100x.

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Dernière mise à jour : 1 août 2026