Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour identifier les phosphorylations multiples dans les protéines

Les phosphorylations multiples dans une protéine impliquent l’ajout de groupes phosphate à la protéine à diverses positions, en particulier au niveau des résidus de sérine et de thréonine.

Pour identifier plusieurs phosphorylations dans une protéine, commencez par un tube contenant des protéines phosphorylées marquées à l’azote-15, qui aide à différencier les hydrogènes amides des autres hydrogènes de la protéine.

Ajoutez un composé de référence RMN interne pour une mesure précise des fréquences de résonance relatives. Transférez le mélange dans un tube à résonance magnétique nucléaire, ou RMN. Insérez le tube dans une ouverture tournante et placez-le dans un spectromètre RMN.

La présence de phosphates présente des effets de retrait d’électrons dans les résidus phosphorylés de sérine et de thréonine. En conséquence, les hydrogènes amides des résidus phosphorylés semblent être déblindés avec des densités d’électrons inférieures à celles des autres hydrogènes amides.

Les hydrogènes amides avec des environnements électroniques variables subissent des champs magnétiques différentiels autour des noyaux, atteignant des états de basse énergie.

Appliquer une brève impulsion de radiofréquence pour exciter les noyaux d’hydrogène à un état d’énergie plus élevé à une fréquence de résonance spécifique basée sur leur environnement électronique.

Pendant la relaxation, les noyaux retournent à un état de basse énergie en libérant l’énergie absorbée, qui est détectée pour produire un signal RMN.

Tracez un spectre RMN bidimensionnel représentant les hydrogènes amides individuels.

Comparez le spectre de la protéine phosphorylée avec celui de la protéine non phosphorylée. L’apparition de résonances supplémentaires dans le spectre RMN de la protéine phosphorylée confirme les phosphorylations multiples.

Solubiliser 4 milligrammes de 15 N et 13 C enrichis en ERK-phosphorylated-Tau enrichis en ¹⁵N et ¹³C dans 400 microlitres de tampon RMN. Ajouter 5 % d’oxyde de deutérium pour le blocage de champ du spectromètre RMN et 1 TMSP millimolaire comme référence de signal RMN interne. Ajoutez également 10 microlitres d’une solution mère 40x d’un cocktail complet d’inhibiteurs de protéase.

Transvaser l’échantillon dans un tube RMN de 5 millilitres à l’aide d’une seringue électronique munie d’une longue aiguille ou à l’aide d’une pipette Pasteur. Fermez le tube RMN à l’aide du piston. Éliminez toutes les bulles d’air coincées entre le piston et le liquide en déplaçant le piston.

Placez le tube RMN dans une cuisse. Utilisez la jauge appropriée pour ajuster sa position verticale dans la cuiller, de sorte que la majeure partie de la solution de l’échantillon se trouve à l’intérieur de la bobine RMN. Ensuite, démarrez le flux d’air dans l’instrument RMN en cliquant sur « Lift » dans la fenêtre du système de contrôle magnétique. Placez soigneusement le cône avec le tube dans le flux d’air en haut de l’alésage de l’aimant, puis arrêtez le flux d’air et laissez le tube descendre en place à l’intérieur de la tête de sonde à l’intérieur de l’aimant.

Après avoir laissé l’échantillon s’équilibrer à 25 degrés Celsius, tapez « atmm » dans la ligne de commande pour effectuer un réglage semi-automatique et une correspondance de la tête de sonde afin d’optimiser la transmission de puissance. Ensuite, cliquez sur « Verrouiller » dans la fenêtre du système de contrôle de l’aimant pour activer le verrouillage de fréquence de champ du spectromètre.

Démarrez la procédure de calage pour optimiser l’homogénéité du champ magnétique à la position de l’échantillon en tapant d’abord 'topshim gui' sur la ligne de commande pour ouvrir la fenêtre de calage. Ensuite, cliquez sur « Démarrer » dans la fenêtre de cale. Vérifiez l’écart-type résiduel B zéro pour vérifier que les cales sont optimales.

Ensuite, calibrez le paramètre P1, qui est la durée d’une impulsion de radiofréquence de proton en microsecondes. Ce paramètre est nécessaire pour obtenir une rotation de 90 degrés de l’aimantation du spin du proton. Visez l’impulsion à 360 degrés en utilisant un spectre unidimensionnel de protons d’eau.

Ajustez le décalage de fréquence en réglant le paramètre 01 sur la fréquence de l’eau du proton dans le spectre unidimensionnel. Enfin, commencez l’acquisition d’un spectre de protons unidimensionnel en tapant 'zg' dans la ligne de commande.