La technique de spectroscopie de dichroïsme circulaire pour étudier les interactions ADN-protéines
JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 4:38 min • July 8th, 2025
protéines de remodelage de la chromatine dépendantes de l’ATP régulent l’expression des gènes dans la chromatine serrée en modifiant la conformation de l’ADN de manière dépendante de l’ATP.
Pour étudier les interactions entre le remodeleur de la chromatine et l’ADN à l’aide de la spectroscopie de dichroïsme circulaire, ou CD, prenez une solution d’oligonucléotides d’ADN double brin. Chauffer pour dénaturer les oligonucléotides, et placer sur de la glace.
Le refroidissement rapide provoque la renature de l’ADN tout en formant des structures secondaires. La région de transition double à simple brin fournit un site de liaison optimal pour les remodeleurs de la chromatine.
Ajoutez l’ADN refroidi thermiquement dans une cuvette. Ajoutez un tampon contenant un remodeleur de chromatine dépendant de l’ATP, de l’ATP et des ions magnésium.
Le remodeleur se lie à l’ADN, puis se lie à l’ATP complexe par des ions magnésium à la protéine, l’activant. Le remodeleur activé hydrolyse l’ATP - induisant une conformation tige-boucle dans l’ADN.
Faites passer la lumière polarisée circulairement gauche et droite, avec une différence de phase de 90°, à travers l’échantillon. L’ADN optiquement chiral absorbe la lumière polarisée circulairement gauche et droite à des degrés divers.
L’absorption différentielle, appelée dichroïsme circulaire, entraîne une polarisation elliptique de la lumière transmise, ce qui est mesuré par l’ellipticité. Deux pics positifs à des longueurs d’onde spécifiques dans les spectres CD confirment la structure de la boucle de tige.
Ajoutez de l’EDTA pour chélater les ions magnésium, inhibant l’activité de l’ATPase.
Un changement dans les spectres CD lors de la chélation - montrant un pic négatif et un large pic positif à des longueurs d’onde spécifiques - indique la rupture de la conformation tige-boucle en l’absence d’hydrolyse de l’ATP.
Collectez les spectres de CD dans des cuvettes en quartz haute transparence. Utilisez des cuvettes rectangulaires ou cylindriques. Pour nettoyer les cuvettes, lavez-les plusieurs fois à l’eau, puis faites un balayage de l’eau ou du tampon dans la cuvette pour vérifier si elle est propre.
Pour les réactions, utilisez des oligonucléotides d’ADN purifiés par PAGE. Pour un refroidissement rapide, chauffez l’ADN à 94 degrés Celsius pendant 3 minutes sur le bloc chauffant et refroidissez-le immédiatement sur de la glace. Pour un refroidissement lent, après avoir chauffé l’ADN à 94 degrés Celsius pendant 3 minutes, laissez-le refroidir à température ambiante à un taux de 1 degré Celsius par minute.
Pour enregistrer les spectres de référence, mettez en place un total de 5 réactions de contrôle, une par une, dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre. Maintenez le volume de réaction à 300 microlitres dans toutes les réactions.
Pour enregistrer les spectres CD, mettez en place un total de cinq réactions expérimentales une par une dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre.
Pour enregistrer le balayage, allumez le gaz et allumez le spectromètre CD. Après 10 à 15 minutes, allumez la lampe, allumez le bain-marie et réglez la température du support à 37 degrés Celsius.
Ensuite, ouvrez le logiciel de spectre CD et réglez la température à 37 degrés Celsius, la gamme de longueurs d’onde à 180 à 300 nanomètres, le temps par point à 0,5 seconde et le nombre de balayage à 5. Ensuite, cliquez sur le Pro-Data Viewer, créez un nouveau fichier et renommez-le avec les détails de l’expérience et la date.
Ensuite, mélangez les réactions de base et expérimentales par pipetage, et transférez soigneusement les mélanges de réaction un par un dans la cuvette, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air.
Si vous effectuez une expérience dans le temps, incubez les réactions à 37 degrés Celsius pendant le temps requis. Ensuite, effectuez le scan. Ajoutez de l’EDTA au tampon contenant l’ADN, l’ATP, le magnésium et les protéines pour arrêter l’hydrolyse de l’ATP. Pour inhiber complètement l’activité de l’ATPase, augmentez la concentration d’EDTA et le temps d’incubation.
Soustrayez les lignes de base des réactions correspondantes dans le logiciel et lissez les données soit dans le logiciel de spectre CD, soit dans le logiciel de traçage de données. Ensuite, tracez un graphique de la longueur d’onde en fonction de l’ellipticité moyenne des résidus et analysez les pics.
Aperçu
Cette étude examine le rôle des protéines de remodelage de la chromatine dépendantes de l'ATP dans la régulation de l'expression génique en modifiant la conformation de l'ADN. À l'aide de la spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD), les interactions entre les remodelants de la chromatine et l'ADN sont analysées.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Remodelage de la chromatine
- Régulation de l'expression des gènes
- Techniques biophysiques
Contexte
- La remodelage de la chromatine est essentiel à l'expression des gènes dans les cellules eucaryotes.
- Les remodelants de chromatine dépendants de l'ATP modifient la structure de l'ADN afin de faciliter la transcription.
- La spectroscopie de dichroïsme circulaire peut fournir des informations sur la conformation de l'ADN.
- Comprendre ces interactions est crucial pour élucider les mécanismes de régulation génique.
Objectif de l'étude
- Explorer comment les remodelants de la chromatine interagissent avec l'ADN.
- Caractériser les changements conformationnels dans l'ADN induits par l'hydrolyse de l'ATP.
- Utiliser la spectroscopie de dichroïsme circulaire comme méthode pour analyser ces interactions.
Méthodes utilisées
- Préparation d'oligonucléotides d'ADN double brin.
- Dénaturation et renaturation de l'ADN pour former des structures secondaires.
- Liaison des remodelants de la chromatine et de l'ATP à l'ADN.
- Mesure des spectres de dichroïsme circulaire pour analyser les changements conformationnels de l'ADN.
Résultats principaux
- Les spectres CD présentaient des pics distincts indiquant la formation d'une structure en épingle à cheveux.
- La chélation par l'EDTA a perturbé la conformation en épingle à cheveux, confirmant le rôle de l'ATP.
- Les réactions de référence et expérimentales ont été correctement enregistrées et analysées.
- Le lissage des données et le tracé des graphiques ont révélé des résultats significatifs concernant la structure de l'ADN.
Conclusions
- Les remodelants de la chromatine dépendants de l'ATP modifient considérablement la conformation de l'ADN.
- La spectroscopie de dichroïsme circulaire est une méthode efficace pour étudier ces interactions.
- L'étude améliore la compréhension des mécanismes de régulation génique dans la chromatine.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La spectroscopie de dichroïsme circulaire permet une détection mécanistique des cibles des remodelants de la chromatine en fournissant des mesures quantitatives et sans marquage des changements conformationnels de l'ADN. Cela soutient la validation des cibles en phase initiale de découverte en reliant l'activité dépendante de l'ATP à des résultats structuraux, éclairant ainsi les décisions de poursuite ou d'abandon dans les programmes de découverte de médicaments épigénétiques. Cette technique offre une confiance prédictive quant au mécanisme de la cible avant le développement de tests ou des campagnes de criblage.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge une hypothèse thérapeutique en mesurant les changements structuraux de l'ADN dépendants de l'ATP induits par les remodelants de la chromatine.
- Valeur opérationnelle : Fournit des mesures quantitatives d'ellipticité sans marquage, permettant de préciser le mécanisme d'action sans recourir à des marqueurs fluorescents.
- Valeur prédictive : Permet une détection précoce des risques biologiques en confirmant l'interaction avec la cible grâce aux modifications conformationnelles de l'ADN.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère des spectres CD reproductibles dans des cuvettes en quartz à température contrôlée (37°C) et dans une gamme de longueurs d’onde définie (180–300 nm).
- Données quantitatives : Fournit des mesures d’ellipticité moyenne par résidu permettant de détecter la formation et la dissociation des structures en épingle à cheveux par décalage des pics.
- Reproductibilité : La soustraction du blanc et le lissage des données permettent des comparaisons cohérentes entre différentes conditions expérimentales.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité mécanistique : Relie l'activité ATPase à la conformation de l'ADN, soutenant une validation ciblée alignée sur les biomarqueurs dans les voies épigénétiques.
- Avancement ajusté au risque : Le contrôle par chélation avec l'EDTA confirme la dépendance à l'ATP, permettant une priorisation des composés fondée sur le mécanisme.
- Pertinence translationnelle : La conformation en épingle à cheveux sert de lecteur structural pour des tests fonctionnels ultérieurs en biologie de la chromatine.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Placée entre l'hypothèse cible et l'identification du composé précurseur, la spectroscopie CD valide l'engagement mécanistique avant le criblage des composés, réduisant ainsi les faux positifs dans les programmes ciblant les mécanismes épigénétiques.
- Biologie de la découverte : Teste l'hypothèse d'une interaction entre les remodeleurs de la chromatine et l'ADN par l'observation directe d'un changement conformationnel induit par l'ATP.
- Tri : Prépare des substrats d'ADN standardisés et définis sur le plan conformationnel pour des dosages fiables d'interaction ou d'inhibition par des composés.
- Analytique : Mesure l'ellipticité à des longueurs d'onde spécifiques afin de quantifier les états structuraux, permettant la comparaison entre conditions avec et sans ATP.
- Recherche translationnelle : Fournit un lien mécanistique entre la validation de la cible et les modèles précliniques en confirmant le remodelage de l'ADN dépendant de l'ATP.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme biophysique réutilisable pour le criblage de composés ciblant la chromatine au sein de plusieurs familles de remodeleurs.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles de la chromatine grâce à des lectures structurales directes.
- Valeur opérationnelle : Permet la standardisation par le biais de protocoles de nettoyage des cuvettes, de contrôles de base et de mesures à température fixe.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en réduisant les risques associés aux cibles dès les premières étapes, minimisant ainsi les investissements dans des composés non mécanistiques.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des cibles épigénétiques fondée sur la validation conformationnelle dépendante de l'ATP.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en spectroscopie biophysique et en manipulation des acides nucléiques.
- Dépend d'un spectromètre de dichroïsme circulaire, de cuvettes en quartz et d'un bain d'eau à température contrôlée.
- Exige des conditions tampon normalisées et une soustraction du signal de fond pour assurer la précision des données.
- L'adaptation à d'autres structures d'acides nucléiques peut nécessiter une optimisation des conditions de renaturation.
- Limité aux systèmes solubles et purifiés ; non adapté aux formats à haut débit ou aux systèmes cellulaires.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026