Immunodosage direct basé sur la spectroscopie Raman pour détecter un antigène spécifique

Commencez par incuber des molécules de colorant rapporteur Raman avec des nanoparticules d’or pour que les rapporteurs se lient aux nanoparticules.

Ajoutez du polyéthylène glycol, des anticorps conjugués au PEG spécifiques à l’antigène cible. Les anticorps se fixent de manière covalente aux nanoparticules par liaison au disulfure d’or. Ajoutez des PEG conjugués au thiol pour bloquer les sites de nanoparticules restants et empêcher l’agrégation de nanoparticules, formant ainsi des sondes de nanoparticules.

Enduisez les puits de la plaque d’immunodosage avec l’antigène cible. Bloquez les sites de plaque restants avec une solution contenant des protéines. Ajouter les sondes à nanoparticules. Effectuer une dilution en série de la sonde à travers les puits. Incuber pour que les anticorps des sondes se lient aux antigènes, formant des complexes.

Utilisez un microscope Raman pour déterminer la réponse optique de la sonde. Le laser monochromatique incident excite les électrons de surface des nanoparticules d’or et provoque leur oscillation, créant un champ électromagnétique local élevé à la surface de la sonde.

Le faisceau incident et les rapporteurs Raman interagissent, provoquant une lumière inélastique améliorée ou une diffusion Raman avec différentes longueurs d’onde et fréquences en raison du champ électromagnétique amélioré. Le signal Raman émis de manière inélastique est utilisé pour générer le spectre Raman.

Tracez la zone spectrale du pic rapporteur Raman par rapport à la concentration de la sonde pour trouver la limite inférieure de détection de la sonde et faciliter une détection plus sensible de l’antigène.

Afin de préparer les sondes Raman, il faut d’abord fabriquer deux lots de 1,5 millilitre de nanoparticules d’or et le rapporteur Raman à des concentrations déterminées comme décrit dans le protocole de texte ci-joint.

Pour ce faire, on combine le rapporteur Raman et les solutions de nanoparticules d’or et on leur permet de se lier pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez la solution d’anticorps pégylés à l’une des solutions de nanoparticules d’or liées au rapporteur pour créer un rapport de 200 à 1 entre les anticorps et les particules. Cette solution concernera les échantillons de test.

Dans un tube de microcentrifugation séparé, ajoutez un antigène pégylé à l’autre solution de nanoparticules d’or liée au rapporteur dans un rapport de 200 à 1 entre l’antigène et les particules à utiliser comme témoin. Incuber les deux solutions pendant 30 minutes à température ambiante.

Ensuite, bloquez les sites restants à la surface de la nanoparticule. Pour ce faire, il faut d’abord dissoudre le méthoxy polyéthylène glycol thiol solide à une concentration de 200 micromolaires à l’aide d’eau HPLC. Agitez la solution jusqu’à ce que le thiol soit complètement dissous. Ensuite, ajoutez la solution de thiol dans un rapport de 40 000 à 1 avec les solutions d’anticorps PEG liés aux nanoparticules, et incubez la solution à température ambiante pendant 10 minutes pour vous assurer que les sites restants sur la nanoparticule d’or sont bloqués.

Ensuite, récupérez les sondes Raman fonctionnalisées en centrifugant les particules dans des tubes à centrifuger à faible limite afin que le surnageant soit clair. Retirez le surnageant par pipetage mais veillez à ne pas déranger les nanoparticules. Ensuite, mettez les nanoparticules en suspension avec 1 millilitre de PBS.

Estimez la concentration de nanoparticules d’or en prenant une mesure UV-Visible à partir d’environ trois microlitres de solution et comparez les résultats à ceux d’une concentration connue de nanoparticules d’or, car il s’agit d’une relation linéaire.

Si les nanoparticules ne sont pas suffisamment bloquées, elles s’agrègeront en raison des forces d’adhérence entre les particules, ce qui suggère que les réactifs ont été ajoutés à des concentrations incorrectes. Normalement, la solution est d’une couleur rouge foncé, mais l’agrégation crée une teinte grise.

Ajustez le volume de manière à ce que les solutions finales soient d’au moins 1 x 10¹¹ particules par millilitre et stockez les solutions à 4 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pour fonctionnaliser la plaque d’immunoessai. Utilisez ces solutions dans un délai d’une semaine. Tout d’abord, préparez suffisamment d’antigène dilué pour remplir les puits de polystyrène. Ensuite, vortex la solution et ajoutez immédiatement la solution dans les puits des plaques.

Laisser l’antigène se lier aux plaques pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, retirez l’excès de solution antigénique en jetant la solution et en frappant l’assiette contre une table recouverte d’essuie-tout. Ajoutez du TBST dans les puits pour laver la surface. Ensuite, retirez le linge en jetant à nouveau la solution et en frappant l’assiette contre une table recouverte d’essuie-tout.

Ensuite, bloquez les sites de liaison restants sur la plaque pour éviter la liaison non spécifique en ajoutant 70 microlitres de solution bloquant le HSA à chaque puits de la plaque et en incubant la plaque à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, retirez la solution de blocage et rincez la plaque trois fois avec du TBST, comme démontré précédemment. Après avoir retiré le rinçage final, couvrez l’assiette et rangez-la au sec à 4 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure.

Ajoutez 140 microlitres de nanoparticules de sonde préalablement préparées dans la première colonne d’une plaque de 96 puits, en plaçant les nanoparticules d’essai dans les cinq premières rangées et les nanoparticules de contrôle dans les trois dernières rangées. Ajoutez 70 microlitres de PBS à toutes les autres colonnes.

Diluez chaque colonne en utilisant une dilution en série de 1 à 2. Commencez par prendre 70 microlitres de la première colonne et mélangez-les avec la seconde. Ensuite, prenez 70 microlitres de la deuxième colonne et ajoutez-les à la troisième, et ainsi de suite. Laissez la plaque incuber pendant au moins une heure.

Ensuite, retirez les sondes de nanoparticules non liées et lavez la plaque avec du TBST cinq fois, comme démontré précédemment. Après le lavage final, ajoutez 70 microlitres de PBS dans chaque puits et couvrez la plaque avec un joint de plaque. Vérifiez que les échantillons de contrôle sont clairs. S’il y a eu liaison non spécifique, les échantillons de contrôle auront une couleur similaire à celle des échantillons d’essai.

À l’aide d’un microscope Raman inversé, focalisez l’objectif sur la surface du puits où se trouvent les sondes de nanoparticules d’or. Obtenez les spectres Raman du puits. Prélevez un spectre allant de 1800 centimètres inverses à 400 centimètres inverses et répétez cette opération pour chaque puits. Enfin, suivez les étapes de la dernière section du protocole texte qui l’accompagne pour déterminer la sensibilité de la configuration.