Isolement des monocytes du sang total par sélection immunomagnétique négative
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 4:27 min • July 8th, 2025
Pour isoler les monocytes, un type de globule blanc, à partir du sang total par sélection immunomagnétique négative, obtenez du sang humain traité aux anticoagulants dans un tube. Ajoutez une solution cocktail d’anticorps contenant des anticorps bloquant les récepteurs Fc et des complexes d’anticorps tétramères bispécifiques.
Chaque complexe d’anticorps comprend deux anticorps monoclonaux, l’un spécifique des antigènes de surface cellulaire sur les cellules non monocytaires, y compris les globules blancs et rouges, et l’autre anticorps spécifique du dextran.
Ajouter une solution de billes magnétiques recouvertes de dextran. Couver. L’anticorps bloquant le récepteur Fc se lie au récepteur Fc des monocytes, empêchant la liaison non spécifique des anticorps monoclonaux.
Les anticorps monoclonaux dans les complexes d’anticorps reconnaissent et se lient à des antigènes de surface cellulaire spécifiques sur les cellules non monocytaires, laissant les monocytes non marqués. Les billes magnétiques enrobées de dextran se lient à l’anticorps anti-dextran des complexes d’anticorps, réticulant les cellules non monocytaires aux billes.
Placez le tube dans un support magnétique. Sous l’influence d’un champ magnétique à gradient élevé, les cellules réticulées par billes magnétiques se lient aux parois du tube, laissant les monocytes au centre du tube.
Pipeter la solution contenant des monocytes et transférer dans un tube frais. Ajoutez des billes magnétiques, en réticulant les cellules indésirables restantes. Placer sous l’influence d’un champ magnétique, enrichissant la population de monocytes.
Transférez la suspension monocytaire dans un tube frais. Centrifuger la suspension. Remettre les monocytes en suspension dans un tampon pour une analyse plus approfondie.
Après avoir recueilli 40 millilitres de sang total humain frais dans quatre tubes à vide EDTA de 10 millilitres, utilisez une technique stérile pour transférer tout le sang dans un seul tube conique en propylène de 50 millilitres dans une enceinte de biosécurité. En suivant les instructions du fabricant d’un kit d’isolement de monocytes humain sélectionné, ajoutez 2 millilitres de cocktail d’isolement de monocytes du kit dans le tube de sang, et faites tourbillonner les billes magnétiques du kit pendant 30 secondes.
Ajoutez 2 millimètres de billes au sang et utilisez une pipette sérologique de 25 millilitres pour mélanger soigneusement les billes avec le sang. Après cinq minutes à température ambiante, répartissez le sang également entre quatre tubes de 50 millilitres et ajoutez 30 millilitres de PBS stérile complété par 1 millimolaire d’EDTA dans chaque tube. Mélangez à nouveau avec une pipette sérologique en plastique de 25 millilitres et placez les tubes dans des supports magnétiques.
Après 10 minutes, utilisez une pipette pour prélever le contenu au centre de chaque tube, en prenant soin de ne pas aspirer plus de 1 millilitre de globules rouges, et distribuez le contenu du tube dans l’un des quatre nouveaux tubes de 50 millilitres. Ajoutez 500 microlitres supplémentaires de billes magnétiques vortex dans chaque tube et mélangez doucement la solution cellulaire. Replacez les tubes dans les supports magnétiques pendant cinq minutes, avant de transférer soigneusement le contenu du centre de chaque tube dans l’un des quatre nouveaux tubes de 50 millimètres.
Lorsque toutes les suspensions de cellules ont été transférées, placez chaque nouveau tube de 50 millilitres dans les supports d’aimants pendant cinq minutes avant de transférer soigneusement le contenu du tube dans un troisième ensemble de quatre nouveaux tubes de 50 millilitres. Ensuite, collectez les cellules par centrifugation et remettez en suspension les quatre granules de cellules dans un total de 10 millilitres de PBS stérile pour le comptage.
Aperçu
Cet article décrit une méthode d'isolement des monocytes à partir de sang total humain en utilisant une sélection négative immunomagnétique. Le processus implique l'utilisation de mélanges d'anticorps et de billes magnétiques afin d'enrichir la population de monocytes pour des analyses ultérieures.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Immunologie
- Hématologie
Contexte
- Les monocytes sont un type de globule blanc important pour la réponse immunitaire.
- L'isolement des monocytes est essentiel pour étudier leur fonction et leur comportement.
- La sélection négative immunomagnétique est une technique utilisée pour enrichir des populations cellulaires spécifiques.
- Cette méthode minimise la contamination par d'autres types cellulaires.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour l'isolement des monocytes à partir de sang total.
- Améliorer la pureté des monocytes isolés pour les applications en aval.
- Faciliter la recherche sur la biologie des monocytes et les maladies associées.
Méthodes utilisées
- Prélèvement de sang humain traité par anticoagulant.
- Utilisation de cocktails d'anticorps pour cibler les cellules non monocytaire.
- Application de billes magnétiques revêtues de dextran pour la séparation cellulaire.
- Centrifugation et resuspension des monocytes isolés dans un tampon.
Résultats principaux
- Isolation réussie de monocytes avec une contamination minimale.
- Fort rendement de monocytes viables pour des analyses ultérieures.
- Reproductibilité du protocole démontrée au cours de plusieurs essais.
Conclusions
- La méthode décrite est efficace pour isoler les monocytes à partir de sang humain.
- Cette technique peut être appliquée dans divers contextes de recherche.
- De futures études pourront exploiter les monocytes isolés pour la recherche immunologique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement de monocytes humains primaires permet une interrogation mécanistique de la fonction des cellules immunitaires dans les modèles de maladies inflammatoires et infectieuses. Cette méthode soutient la validation de cibles en fournissant un système cellulaire purifié pour évaluer les effets des composés sur les voies médiées par les monocytes. Des préparations de monocytes de haute pureté améliorent la fiabilité prédictive des stratégies de dé-risque précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'évaluation fonctionnelle de cibles spécifiques aux monocytes dans un contexte cellulaire humain physiologiquement pertinent.
- Valeur opérationnelle : Réduit les signaux perturbateurs provenant de types cellulaires contaminants lors des études d'engagement cible.
- Valeur prédictive : Facilite le criblage orienté par hypothèse de composés immunomodulateurs avec une pertinence translationnelle améliorée.
Tests et développement de tests
- Valeur scientifique : Génère un substrat de monocytes constant pour le développement d'essais normalisés dans les cascades de criblage axées sur l'immunologie.
- Valeur opérationnelle : Assure une isolation cellulaire reproductible, fournissant un matériau initial uniforme pour les essais de réponse dose-dépendante et les essais cinétiques.
- Extensibilité : Compatible avec le traitement parallèle de plusieurs échantillons de donneurs afin d'évaluer la variabilité de la population.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Fournit un système pertinent pour l'Homme afin de modéliser les mécanismes de maladies induites par les monocytes avant une validation in vivo.
- Valeur opérationnelle : Facilite les procédés de découverte de biomarqueurs en permettant des tests de phospho-cytométrie, de sécrétion de cytokines et de phagocytose.
- Atténuation des risques : Renforce la confiance dans la cible en confirmant le mécanisme d'action dans un type cellulaire humain pertinent pour la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant de la validation de cibles jusqu'au développement de tests et aux études mécanistiques précliniques, permettant des cycles itératifs de conception, synthèse et évaluation.
- Biologie de la découverte : Permet l'isolement de monocytes pour l'analyse des voies biologiques et la réduction des risques liés aux cibles dans les projets d'immunologie.
- Tri : Produit des monocytes purifiés adaptés aux criblages à contenu élevé et aux tests fonctionnels.
- Analytique : Permet la mesure quantitative de l'activation des monocytes, de la production de cytokines et de l'expression des marqueurs membranaires.
- Recherche translationnelle : Relie les résultats obtenus in vitro à des modèles de maladies humaines grâce à des phénotypes cellulaires reproductibles.
- Réutilisation institutionnelle : Établit un protocole d'isolement standardisé applicable à plusieurs programmes d'immunologie et d'inflammation.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles en réduisant le bruit biologique provenant des cellules non monocytaires.
- Valeur opérationnelle : Fournit des préparations standardisées et reproductibles de monocytes, minimisant la variabilité entre les expériences.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions d'orientation (go/no-go) en fournissant dès les premières étapes du processus de découverte des données mécanistiques plus fiables.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles fondée sur des réponses validées des monocytes humains.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation aseptique des cellules et en techniques de séparation magnétique.
- Dépend de l'accès à des kits de séparation immunomagnétique et à des supports magnétiques pour tubes.
- Exige une standardisation du prélèvement sanguin quant au moment de la prise et à l'utilisation d'anticoagulants, ceci à travers différents sites.
- L'adaptation à des échantillons de donneurs cryopréservés ou pathologiques peut nécessiter une optimisation du protocole.
- Limite pratique : le rendement et la pureté des monocytes peuvent varier selon l'état de santé du donneur et les retards dans le traitement des échantillons.
F.A.Q. sur la bio-pharmacie
Une cytométrie en flux simple méthode pour mesurer l'absorption du glucose et de glucose Expression Transporter pour monocytes dans les sous-populations de sang total
Vidéos connexes
0 Vues
Quantification de Monocyte Transmigration et de la Formation de mousse cellulaire par des individus souffrant de maladies inflammatoires chroniques
Vidéos connexes
0 Vues
Caractérisation des sous-ensembles de Monocyte humain de sang Flow Cytometry analyse
Vidéos connexes
0 Vues
Sélection immunomagnétique négative : une méthode pour purifier les lymphocytes B des cellules mononucléées du sang périphérique
Vidéos connexes
0 Vues
Culture in vitro et différenciation des monocytes primaires en macrophages
Vidéos connexes
0 Vues
Un test in vitro pour évaluer l’impact immunomodulateur des monocytes sur la prolifération des leucocytes
Vidéos connexes
0 Vues
Une
Vidéos connexes
0 Vues
Détection de nanoparticules fluorescentes Interactions avec immunitaire primaire sous-populations de cellules par cytométrie en flux
Vidéos connexes
0 Vues
Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs
Vidéos connexes
0 Vues
Caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes d'isolement
Vidéos connexes
0 Vues
Dernière mise à jour : 29 août 2026