Isolement des macrophages du ganglion de la racine dorsale de la souris par dissociation mécanique

Le ganglion de la racine dorsale, ou DRG, est un groupe de corps cellulaires neuronaux le long de la moelle épinière qui transportent des informations sensorielles du système nerveux périphérique au système nerveux central. Les lésions nerveuses périphériques provoquent l’accumulation de macrophages dans le DRG et le développement de douleurs neuropathiques.

Pour isoler des macrophages viables à l’aide d’une méthode sans enzyme, prélevez du tissu DRG de souris fraîchement disséqué dans un homogénéisateur rempli d’un tampon glacé pour limiter le stress cellulaire. À l’aide d’un pilon, homogénéisez mécaniquement le tissu pour libérer les cellules.

Filtrer à travers une crépine cellulaire pour éliminer les amas cellulaires et obtenir une suspension unicellulaire dans le flux. L’homogénat de tissu contient des neurones et des cellules non neuronales, qui comprennent des macrophages et de la myéline flottante – la gaine isolante des neurones.

Ajouter l’homogénat filtré dans un tube contenant un milieu à gradient de densité et centrifuger. Sous l’effet de la force centrifuge, les cellules viables avec une densité de flottabilité plus élevée se déposent au fond du tube pour former une pastille, tandis que la myéline reste en suspension. Jetez le surnageant.

Remettez les cellules en suspension dans un tampon contenant des anticorps conjugués aux fluorophores contre les récepteurs de surface cellulaire spécifiques aux macrophages. Incuber pendant la durée requise. L’anticorps se lie à son récepteur sur les cellules macrophages, marquant ainsi par fluorescence la surface cellulaire. Laver pour éliminer les anticorps non liés.

Analysez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux. Un signal de fluorescence spécifique à l’anticorps indique la présence de macrophages dans l’échantillon.

Avant de commencer l’expérience, préparez la solution de travail du milieu à gradient de densité en mélangeant neuf volumes du milieu avec un volume de HBSS 10X sans calcium ni magnésium, et maintenez-le sur de la glace. Confirmez que la souris est complètement anesthésiée par l’absence de réponse au pincement de la patte arrière.

Commencez par placer une souris anesthésiée à l’intérieur d’une hotte chimique en position couchée avec quatre pattes fixées avec du ruban adhésif. Utilisez une pince pour soulever la peau sous la cage thoracique, puis avec des ciseaux chirurgicaux, faites une petite incision pour exposer le foie et le diaphragme. À l’aide des mêmes ciseaux, coupez le diaphragme et la cage thoracique, puis ouvrez la cavité pleurale pour exposer le cœur battant.

Ensuite, avec des ciseaux à iris, coupez rapidement l’appendice auriculaire droit. Une fois le saignement noté, insérez une aiguille de calibre 30 dans l’extrémité postérieure du ventricule gauche et injectez lentement 10 millilitres de PBS 1X pré-refroidi pour perfuser l’animal.

Pour effectuer une laminectomie dorsale, placez la souris en position couchée. À l’aide d’un scalpel de taille 11, faites deux incisions latérales longitudinales profondes en partant de la région thoracique jusqu’à la région sacrée. Ensuite, retirez la peau exposant la couche musculaire dorsale. Ensuite, avec Friedman-Pearson Rongeur, décollez les tissus conjonctifs et les muscles jusqu’à ce que les processus de la colonne lombo-sacrée et les processus transverses bilatéraux soient exposés.

Tout d’abord, utilisez un Rongeur Friedman-Pearson pour ouvrir soigneusement la colonne vertébrale dorsale. Ensuite, basculez entre un Rongeur Friedman-Pearson et des ciseaux à ressort Noyes pour retirer les os vertébraux, exposant la moelle épinière avec des nerfs spinaux intacts attachés. Disséquez soigneusement le DRG lombaire ipsilatéral et controlatéral.

Placez-le dans 1 millilitre de HBSS 1X sans calcium ni magnésium glacé dans un homogénéisateur de tissus Dounce. Homogénéisez le tissu DRG dans l’homogénéisateur Dounce avec un pilon lâche pendant 20 à 25 fois. Placez une passoire stérile en nylon de 70 micromètres dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Utilisez 800 microlitres de 1X HBSS glacé pour mouiller la crépine cellulaire.

À l’aide d’une pipette, prélevez la suspension de tissu homogénéisé de l’homogénéisateur sur la crépine à cellules humides, puis recueillez-la dans le tube conique de 50 millilitres. Rincez l’homogénéisateur deux fois avec 800 microlitres de 1X HBSS glacé, en recueillant le liquide dans le même tube conique de 50 millilitres pour augmenter le rendement.

Ajoutez 1,5 millilitre de milieu à gradient de densité isotonique glacé équilibré dans un tube stérile en polystyrène FACS de 5 millilitres. Transférez l’homogénat de cellule du tube conique de 50 millilitres dans ce tube FACS, et pipetez de haut en bas pour bien mélanger.

Ajoutez 500 microlitres supplémentaires de 1X HBSS pour sceller le dessus. Centrifugez les cellules à 800 fois g pendant 20 minutes à 4 degrés Celsius. Aspirez soigneusement le surnageant contenant de la myéline dans le milieu, sans perturber la pastille cellulaire au fond du tube.

Ajoutez 100 microlitres de PBS contenant 5 % de sérum de bovin fœtal à la pastille et remettez en suspension les cellules DRG. Ensuite, ajoutez l’anticorps CX3CR1-APC de souris alpha aux cellules et incubez dans l’obscurité à 4 degrés Celsius pendant 1 heure.

Lavez les cellules une fois avec 5 millilitres de PBS. Centrifugez les cellules à 360 fois g pendant 8 minutes à 4 degrés Celsius. Aspirez le surnageant, puis remettez en suspension la pastille cellulaire dans 300 microlitres de PBS pour l’analyse FACS.