Isolement de cellules mononucléées du sang périphérique à partir de couches leucocytaires humaines

Les cellules mononucléées du sang périphérique, les PBMC, sont constituées d’une population hétérogène de cellules immunitaires spécialisées, notamment des lymphocytes, des monocytes et des cellules dendritiques.

Pour isoler les PBMC, commencez par un tube contenant du sang de couche leucocytaire humaine fraîchement obtenu. Le sang de la couche leucocytaire contient des PBMC, ainsi que des granulocytes à noyaux multilobés, des érythrocytes et des plaquettes en suspension dans le plasma.

Superposez soigneusement la suspension de la couche leucocytaire sur un volume égal d’un milieu à gradient de densité avec une densité spécifique souhaitée qui est optimale pour la séparation PBMC.

Lors de la centrifugation, les différents types de cellules se séparent en couches distinctes, en fonction des densités cellulaires par rapport au milieu dégradé. De plus, les polysaccharides dans le milieu à gradient de densité favorisent l’agrégation et la sédimentation des érythrocytes.

Les érythrocytes et les granulocytes les plus denses se sédimentent au fond du tube, tandis que le plasma, avec la densité la plus faible, forme la couche supérieure. Les PBMC, qui ont des densités plus faibles que le milieu à gradient de densité, forment une couche blanche nuageuse à l’interface plasma-milieu à gradient de densité.

Retirez la couche supérieure de plasma. Récupérez soigneusement la couche trouble contenant les PBMC et transférez-la dans un tube frais avec un milieu sans sérum. Centrifuger pour granuler les PBMC. Jeter le surnageant contenant les plaquettes et le milieu à gradient résiduel.

Remettre les PBMC en suspension dans un milieu frais et les utiliser pour une analyse plus approfondie.

Pour isoler la PBMC à partir d’enveloppes leucocytaires de donneur humain, utilisez une pipette pour superposer lentement 15 millimètres de sang de couche leucocytaire, sur le côté d’un tube de 50 millilitres, sur 15 millilitres de milieu à gradient de densité, et séparez les cellules par centrifugation. À l’aide d’une pipette Pasteur stérile, retirez la couche supérieure de plasma et transférez soigneusement la couche de cellules mononucléées dans un nouveau tube de 50 millilitres.

Ajoutez un milieu RPMI sans sérum aux cellules jusqu’à un volume final de 50 millilitres et retournez doucement le tube plusieurs fois avant de centrifuger. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 20 millilitres de milieu sans sérum pour le comptage.