Génération in vitro de cellules dendritiques plasmacytoïdes à partir de progéniteurs lymphoïdes communs

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes, ou pDC, sont des cellules immunitaires qui réagissent à l’infection en produisant l’interféron cytokine de type I.

Pour générer des pDC in vitro, prenez une suspension de cellules progénitrices lymphoïdes communes, ou CLP, isolées de la moelle osseuse de souris. Les CLP peuvent se différencier en lymphocytes et en cellules dendritiques.

Ajoutez la suspension cellulaire sur une couche de cellules nourricières – des cellules stromales adhérentes – irradiées par des rayons gamma pour inhiber la prolifération. Les cellules nourricières fournissent les cytokines et le contact cellule-cellule nécessaires à la différenciation des CLP.

Ajoutez une concentration adéquate de ligand tyrosine kinase 3 de type Fms, ou FL - une cytokine bivalente qui favorise le développement de la pDC - et incuber.

Les CLP migrent entre les cellules nourricières et prolifèrent pour former des groupes de cellules, appelés zones de galets.

Le FL dans le milieu se lie au récepteur Flt3 - un récepteur tyrosine kinase - sur les CLP. La liaison induit la dimérisation des récepteurs et l’autophosphorylation des résidus de tyrosine sur le domaine cytoplasmique.

Les protéines adaptatrices cytoplasmiques se lient à ces résidus et deviennent phosphorylées, transduisant le signal vers les composants de signalisation en aval. La cascade de signalisation provoque la différenciation des CLP en pDC - de petites cellules rondes qui se développent en suspension - ainsi qu’en cellules dendritiques conventionnelles, ou cDC - de plus grandes cellules adhérentes en forme de fuseau.

Collectez les cellules. Ajoutez des anticorps contre les marqueurs de surface spécifiques de pDC et de cDC. Analysez les cellules à l’aide de la cytométrie en flux.

Les cellules positives pour les marqueurs spécifiques de pDC et négatives pour les marqueurs spécifiques de cDC indiquent un développement réussi de pDC.

Pour analyser les progéniteurs lymphoïdes communs, ou CLP, par cytométrie en flux, ensuite,_Fc bloque les cellules avec l’anti-CD16/32 pendant une à deux minutes, suivi d’une coloration simultanée des cellules avec le cocktail d’anticorps approprié.

Après 15 minutes sur glace, lavez les cellules dans trois millilitres de tampon FACS et remettez le granulé en suspension dans 300 microlitres de tampon FACS frais. Ensuite, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 micromètres, et triez immédiatement les cellules sur un cytomètre en flux à l’aide des filtres et des tensions appropriés, en collectant les cellules d’intérêt dans un tube de 15 millilitres contenant 8 millilitres de RPMI complet.

Pour générer une population de pDC hautement enrichie, il est crucial de trier la bonne population de CLP à partir de cellules de moelle osseuse récoltées pour la culture in vitro avec le système d’alimentation AC-6.

À la fin du tri, faites tourner les cellules vers le bas et remettez en suspension la pastille de cellule CLP avec suffisamment de RPMI complet pour obtenir une densité cellulaire d’environ 5 fois 10 puissance 4 cellules par millilitre. Ensuite, ensemencez 500 cellules par puits dans la plaque à 12 puits contenant les cellules nourricières de l’AC-6, et complétez les co-cultures avec 100 nanogrammes par millilitre de ligand FLT3. Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec une surveillance visuelle périodique de la cellule dendritique, ou développement de DC, au microscope.

Le 12e jour, récoltez les cellules dans le surnageant de co-culture et lavez chaque puits une fois avec un demi-millilitre de milieu RPMI complet, en regroupant les surnageants et les lavages résultants. Ensuite, ajoutez un demi-millilitre de milieu frais dans chaque puits et utilisez un grattoir cellulaire pour détacher les cellules adhérentes. Combinez les cellules détachées avec les cellules flottantes, et centrifugez la suspension cellulaire résultante, en remettant la pastille en suspension dans 50 microlitres de tampon FACS.

Ensuite, comptez les cellules et colorez-les pour l’expression de CD11c, CD11b et B220 après le blocage de_Fc, comme nous venons de le démontrer. Les cellules co-cultivées peuvent ensuite être analysées pour détecter la présence de populations de DC CD11c conventionnelles positives, CD11b positives, B220 négatives, CD11c plasmacytoïdes positives, CD11b négatives, B220 positives.