Génération de cellules dendritiques immatures, matures et tolérogènes à partir de monocytes

Pour provoquer une réponse immunitaire, les cellules dendritiques, les cellules dendritiques, présentent un antigène affiché avec le CMH de classe II et les molécules co-stimulatrices CD80 et CD86. En fonction des caractéristiques de la réponse immunitaire, ils sont subdivisés en CD immatures, matures et tolérogènes.

Pour générer divers sous-ensembles de cellules dendritiques in vitro, commencez avec une plaque multipuits contenant des monocytes humains – des cellules précurseurs immunitaires dans un milieu complet contenant des facteurs de croissance et la cytokine IL-4 – une molécule de signalisation.

Incuber les cellules pendant une durée prolongée. Les facteurs de croissance et l’IL-4 induisent la prolifération des monocytes et la différenciation en CD immatures.

Les DC immatures possèdent des récepteurs de reconnaissance de formes, des PRR, et expriment des molécules de classe II et de co-stimulation du CMH, présentant une capacité réduite à provoquer une réponse immunitaire.

Traitez un puits contenant des CD immatures avec des agents immunomodulateurs - vitamine D3 et glucocorticoïdes. Ces agents immunomodulateurs régulent à la baisse l’expression du CMH de classe II et des molécules co-stimulatrices. Cela conduit à la différenciation en DC tolérogènes - des cellules immunorégulatrices qui empêchent les réponses immunitaires exagérées ou indésirables.

Traitez un autre puits contenant des DC immatures avec du lipopolysaccharide, LPS - un antigène. Le LPS interagit avec le récepteur 4 des cellules - un PRR, initie une cascade de signalisation et les différencie en cellules matures. Ces cellules expriment des molécules co-stimulatrices de classe II du CMH élevé et des PRR - efficaces pour le traitement et la présentation des antigènes.

Observez les puits traités différentiellement pour les caractéristiques morphologiques distinctes représentant les sous-types de cellules dendritiques.

Ensemencez quatre séries de monocytes CD14+ à une concentration de 0,3 à 0,5 x 10⁶ par millilitre de milieu de culture cellulaire d’IL-4 dans des plaques à six puits. Incuber les cellules dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO₂. Le jour 4, retirez 850 microlitres de milieu de la culture et centrifugez.

Aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de milieu de culture cellulaire. Remettez le mélange cellulaire dans la culture. Le jour 5, ajoutez 1 microlitre de vitamine D3 et 1 microlitre de dexaméthasone par millilitre de milieu à deux des séries pour générer des moDC tolérogènes.

Le jour 6, ajoutez 200 nanogrammes par millilitre de GM-CSF et 200 nanogrammes par millilitre d’IL-4 à tous les ensembles. Ajoutez 1 microgramme par millilitre de LPS à l’un des ensembles traités uniquement avec du GM-CSF et de l’IL-4 pour générer des moDC matures.

Ajoutez 1 microgramme par millilitre de LPS à un ensemble de moDC tolérogènes pour générer des moDC tolérogènes au LPS. Enfin, le jour 7, récoltez les différents types de moDC en rinçant la boîte de culture avec du PBS-EDTA.