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Immunologie
0 vues • 3:58 min • July 8th, 2025
Pour effectuer une séparation immunomagnétique négative des lymphocytes B, prélevez du sang périphérique humain dans un tube contenant un anticoagulant afin d’empêcher la coagulation du sang. Ajoutez des globules rouges, des globules rouges, un tampon de lyse pour lyser les globules rouges sans affecter les autres cellules sanguines.
Centrifuger pour sédimenter les cellules sanguines intactes et plus denses des globules rouges lysés moins denses, qui restent dans le surnageant. Jetez le surnageant. Remettez le granulé en suspension dans un milieu frais.
Transférez les cellules dans une plaque de culture. Incuber pour permettre aux macrophages et aux monocytes d’adhérer à la plaque tandis que les cellules non adhérentes, y compris les cellules B, restent en suspension.
Collectez les cellules en suspension dans un tube frais. Centrifuger pour granuler les cellules et les remettre en suspension dans un tampon.
Ajoutez une solution cocktail contenant des anticorps biotinylés spécifiques des cellules sanguines autres que les cellules B. Les anticorps se lient aux antigènes à la surface des lymphocytes non B, laissant les lymphocytes B non marqués.
centrifugeuse. Jetez le surnageant contenant des anticorps non liés.
Ajouter une solution de billes magnétiques conjuguées à la streptavidine. Pendant l’incubation, la streptavidine contenue dans les microbilles se lie étroitement aux anticorps biotinylés liés aux cellules non B, formant des complexes.
Placez le tube dans un champ magnétique pour faire adhérer les cellules non B liées à des billes magnétiques aux parois du tube, laissant les cellules B en suspension. Transférez le surnageant contenant des lymphocytes B purs dans un tube.
Centrifugez et mettez en suspension les cellules B dans le milieu pour une analyse ultérieure en aval.
Immédiatement après avoir obtenu un échantillon de sang de 10 millilitres de la veine cubitale médiane dans un tube de 15 millilitres contenant de l’EDTA supplémenté en potassium, retournez le tube plusieurs fois pour empêcher la formation de caillots. Ensuite, ajoutez 35 millilitres de tampon de lyse des globules rouges autoclavé aux cellules pour une incubation de 5 minutes à température ambiante.
Lorsque la lumière peut être observée à travers le tube, centrifugez le sang et confirmez la présence d’une pastille blanche. Retirez le tampon de lyse résiduelle avec 10 millilitres d’autoclave sur PBS et remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu RPMI 1640.
Placez les cellules dans une boîte de culture de 10 centimètres pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, faites tourner doucement la boîte de culture plusieurs fois et transférez les cellules flottantes dans un tube conique en plastique de 15 millilitres.
Après deux lavages par centrifugation, remettre la pastille en suspension à une concentration de 5 à 10 x 106 cellules par millilitre dans 200 microlitres de tampon PBS froid, et ajouter 5 microlitres de cocktail d’anticorps anti-humains biotinylés spécifiques pour les cellules sanguines par 1 x 106 cellules.
Après une incubation de 30 minutes sur de la glace, lavez les cellules dans un volume 10 fois plus important de PBS stérile et remettez la pastille en suspension dans 5 microlitres de microbilles conjuguées à la streptavidine par 1 x 106 cellules pour une incubation de 30 minutes sur glace. À la fin de l’incubation, ajoutez 2 millilitres de tampon PBS dans les cellules et placez le tube sur un support magnétique pendant 8 minutes à température ambiante.
Lorsque les microbilles se sont fixées à la paroi du tube, transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube conique et ajoutez 2 millilitres supplémentaires de tampon PBS aux cellules. Après la deuxième collecte de surnageants, prélever les cellules regroupées par centrifugation et transférer les cellules dans un tube de polystyrène de 5 millilitres dans un tampon PBS frais à une concentration de 1 x 107 cellules par millilitre.