Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 3:01 min • July 8th, 2025
Sur la base de leurs récepteurs de surface cellulaire, les lymphocytes B circulants humains sont classés en cellules B naïves CD19-positives, CD19 et CD27-positives, et plasmablastes CD19, CD27 et CD38-positifs.
Pour trier ces populations cellulaires, prenez une suspension de lymphocytes B purifiés. Incuber avec des anticorps d’immunoglobuline G humaine. Les anticorps bloquent les récepteurs Fc des lymphocytes B, empêchant la liaison d’anticorps non spécifiques.
Ajoutez des anticorps marqués par fluorescence ciblant CD19, CD27 et CD38.
Les anticorps anti-CD19 se lient aux récepteurs CD19 exprimés de manière ubiquitaire sur les lymphocytes B.
Les anticorps anti-CD27 se lient aux récepteurs CD27 exprimés sur les lymphocytes B à mémoire et les plasmocytes plasmablastiques.
Les anticorps anti-CD38 se lient aux récepteurs CD38 exprimés sur les plasmocytes plasmablastiques.
Ajoutez un colorant fluorescent de liaison à l’ADN comme marqueur de cellules mortes.
Les cellules mortes présentent une perte d’intégrité membranaire, ce qui permet l’entrée cellulaire du colorant et la liaison à l’ADN double brin ; les cellules vivantes restent non colorées.
Centrifugeuse pour éliminer les anticorps et les colorants non liés et remettre les cellules en suspension dans le tampon FACS. Filtrer les cellules à travers une passoire pour obtenir une suspension homogène et éliminer les grumeaux.
À l’aide d’un cytomètre en flux, triez les cellules mortes des cellules vivantes. Au sein des cellules vivantes, l’expression de CD19, CD27 et CD38 distingue les lymphocytes B naïfs, les lymphocytes B à mémoire et les plasmocytes plasmablastiques.
Après avoir effectué un blocage non spécifique, ajoutez 1 microgramme de chaque anticorps de sélection par 1 x 106 cellules dans le tube en mélangeant doucement pour une incubation de 30 minutes sur glace. Pendant les cinq dernières minutes de l’incubation, ajoutez 5 microlitres de 7-AAD dans les cellules. Ensuite, ajoutez 2 millilitres de PBS frais dans les cellules et vortex avant de centrifuger.
Remettez le granulé en suspension dans un tampon de tri frais à une concentration de 1 à 5 x 107 cellules par millilitre, et filtrez les cellules à travers une crépine de 40 microns dans un nouveau tube de polystyrène de 5 millilitres. Ensuite, triez les cellules par cytométrie en flux dans trois tubes de 15 millilitres contenant 5 millilitres de milieu RPMI frais pour collecter les lymphocytes B naïfs, les lymphocytes B à mémoire et les plasmocytes plasmablastiques.