Évaluation fonctionnelle des lymphocytes B sécrétant des anticorps à l’aide du dosage ELISpot

Les lymphocytes B sécrétant des anticorps, ou ASC, sont des lymphocytes B différenciés qui sécrètent des isotypes d’anticorps, y compris les IgG et les IgM, pour assurer une protection contre les agents pathogènes.

Pour effectuer une évaluation fonctionnelle des ASC in vitro, commencez par le dosage ponctuel immuno-enzymatique. Prenez une plaque ELISpot contenant une membrane de fluorure de polyvinylidène activée à la base.

Incuber les puits avec des fragments d’anticorps polyclonaux contenant exclusivement des régions Fab sans la région Fc de l’anticorps. Chaque région Fab possède un site de liaison pour des isotypes d’anticorps spécifiques – IgG ou IgM, permettant l’identification des deux isotypes.

Pendant l’incubation, les fragments d’anticorps se fixent à la membrane, entraînant une immobilisation.

Recouvrir les puits de solutions de blocage pour éviter les liaisons non spécifiques. Ensemencez la plaque avec des lymphocytes B sécrétant des anticorps activés et incuberez. Les ASC sécrètent différents isotypes, y compris les IgG et les IgM, qui se lient aux fragments d’anticorps liés à la membrane.

Lavez la plaque avec un tampon pour éliminer les anticorps sécrétés non liés. Traitez certains puits avec des anticorps de détection conjugués aux enzymes pour les IgM et d’autres avec des anticorps de détection pour les IgG, et incubez.

Les anticorps de détection se lient à leurs isotypes respectifs, formant des immunocomplexes.

Ajoutez des substrats colorimétriques à tous les puits, qui interagissent avec les enzymes et produisent des taches de couleur violette sur la membrane. Ajoutez une solution d’arrêt pour arrêter la réaction.

La tache colorée produite dans chaque puits indique la présence de l’isotype spécifique de l’anticorps, en corrélation avec l’activité sécrétoire des lymphocytes B.

Lorsque toutes les cellules ont été récoltées, ensemencez les sous-ensembles dans des puits individuels d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits à une concentration de 1 à 10 x 10⁵ cellules par millilitre dans un milieu RPMI frais. Ensuite, activez les cellules B avec 5 microgrammes de CpG (ODN 2006) par 1 x 10⁶ cellules par millilitre par puits dans l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq jours.

À la fin de l’activation, ajoutez 30 microlitres d’éthanol à 35 % dans de l’eau distillée dans chaque puits des plaques ELISpot pendant 30 secondes. Ensuite, remplacez l’éthanol dans chaque puits par 150 microlitres d’eau doublement distillée autoclavée, et incubez les plaques à température ambiante pendant 5 minutes pour éliminer l’éthanol résiduel. Effectuer un lavage PBS, suivi de l’ajout de 50 microlitres du fragment polyclonal F(ab')2 d’Ig anti-humaines dans chaque puits.

Lavez les assiettes deux fois avec du PBS, comme nous venons de le démontrer. Bloquez la liaison non spécifique dans chaque puits avec 200 microlitres de PBS frais avec BSA pendant deux heures à température ambiante. Après une autre série de lavages PBS, incubez les puits dans 100 microlitres de milieu frais RPMI 1640 à 37 degrés Celsius. Ensuite, remplacez le milieu dans chaque puits ELISpot par le nombre approprié de cellules B activées.

Portez le volume final de chaque puits à 150 microlitres avec un milieu RPMI frais. Ensuite, remettez la plaque ELISpot dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 8 à 14 heures. À la fin de la période d’incubation, jetez le milieu et lavez les puits avec 200 microlitres de PBS plus Tween 20 pour cinq lavages de 3 minutes.

Après le dernier lavage, ajoutez les anticorps de détection appropriés dans leurs puits correspondants et incubez les plaques pendant deux heures dans l’obscurité. Après une autre série de lavages PBS, ajoutez 50 microlitres de substrat BCIP/NBT dans chaque puits pendant 5 à 15 minutes à température ambiante.

Lorsque des taches violettes apparaissent, arrêtez la réaction avec 100 microlitres d’eau doublement distillée par puits et rincez la plaque à l’eau courante du robinet. Ensuite, faites sécher à l’air libre les membranes ELISpot à l’abri de la lumière.