Isolement de cellules T basé sur la flottation à l’aide d’un tri cellulaire activé par flottabilité

Pour isoler les lymphocytes T – des globules blancs essentiels au système immunitaire – à l’aide du tri cellulaire activé par flottabilité, BACS, prenez une suspension de cellules mononucléées du sang périphérique, PBMC. Les PBMC contiennent des lymphocytes T cibles et des cellules non cibles comme les lymphocytes B, les monocytes, les cellules tueuses naturelles et les cellules dendritiques.

Ajoutez un tampon contenant une quantité adéquate d’anticorps anti-CD3 biotinylés et incubez pendant la durée requise. L’anticorps se lie au complexe CD3 – un complexe protéique multimérique à la surface de la cellule – une caractéristique déterminante des lymphocytes T.

Ajoutez des microbulles fonctionnalisées – de petites particules sphériques enrobées de streptavidine – pour une sélection positive des lymphocytes T liés aux anticorps. Le cœur de chaque microbulle est une sphère creuse, ce qui en fait des particules de faible densité capables de flotter dans une solution aqueuse.

Incuber le mélange sous agitation, en laissant les microbulles et l’échantillon se mélanger complètement. Pendant l’incubation, la streptavidine sur la microbulle se lie à la biotine sur l’anticorps lié aux lymphocytes T, immobilisant les cellules sur les microbulles.

Centrifugez le tube. Les cellules non cibles se séparent du mélange sous forme de pastille au fond.

Les microbulles liées aux lymphocytes T cibles restent à flot à la surface, ce qui entraîne une séparation des lymphocytes T basée sur la flottabilité. Cette technique de séparation limite le stress sur les cellules cibles. À l’aide d’une pipette fine, retirez la pastille et le sous-nageant sans perturber la couche de microbulles.

Remettre en suspension les lymphocytes T isolés liés à des microbulles dans un milieu de culture approprié pour un traitement ultérieur.

Pour commencer, incubez 3 x 10⁸ PBMC obtenus dans le commerce dans 2,5 millilitres de tampon de séparation avec un anticorps anti-CD3 biotinylé. Mélangez délicatement les composants par pipetage et incubez-les à température ambiante pendant 10 minutes.

Ajoutez des microbulles de streptavidine dans les cellules dans un rapport de 0,5 à 1, selon les instructions du fabricant, et mélangez à l’aide d’un rotateur commercial de bout en bout à 20 tr/min pendant 10 à 15 minutes à température ambiante. Centrifuger à 400 x g pendant 5 minutes à température ambiante.

Après la centrifugation, les cellules sélectionnées positivement seront en haut de la suspension avec les microbulles de streptavidine, et les cellules non sélectionnées restantes seront dans la pastille cellulaire au fond du tube.

À l’aide d’une pipette en verre de 9 pouces, insérez la pointe sous la couche de cellules à bulles jusqu’au bas du tube. Aspirez la pastille de cellule et le sous-nageant à l’aide d’une pipette électronique et transférez-les dans un nouveau tube.

Remettez en suspension la couche de cellules à bulles laissée dans le tube d’origine dans 1 millilitre de milieu complet à cellules T. Centrifugez le subnatant à 400 x g pendant 5 minutes à température ambiante et utilisez-le pour la mesure indirecte de la pureté et de la récupération.