Culture de lymphocytes T activés à partir de cellules mononucléées du sang périphérique humain

De multiples interactions récepteurs-ligands à la surface cellulaire entre les lymphocytes T naïfs et les cellules présentatrices d’antigènes, les APC, provoquent l’activation et la prolifération des lymphocytes T.

Les deux événements principaux de ce processus impliquent la reconnaissance de l’antigène exprimé par l’APC par le complexe récepteur CD3-T-T, suivie de l’interaction entre le ligand B7 exprimé par APC et le récepteur T CD28.

Pour étudier l’activation et la prolifération des lymphocytes T in vitro, il faut prendre des cellules mononucléées du sang périphérique humain, PBMC, en suspension dans un milieu de culture approprié. Ajoutez des billes magnétiques recouvertes d’anticorps anti-CD3 et anti-CD28, et divisez les cellules en deux tubes coniques.

Ajoutez la cytokine interleukine-2, IL-2, dans le premier tube et l’interleukine-15, IL-15, dans l’autre. Transférez les cellules dans une plaque multi-puits. Couver.

Les anticorps anti-CD3 et anti-CD28 des billes se lient au complexe récepteur des lymphocytes T CD3 et au récepteur CD28 exprimés sur les lymphocytes T, respectivement, provoquant l’activation et la prolifération des lymphocytes T.

Avec l’IL-2, la cytokine se lie à son récepteur à la surface des lymphocytes T activés, ce qui entraîne sa différenciation et sa prolifération en lymphocytes T effecteurs. À l’inverse, l’IL-15 entraîne principalement la différenciation et la prolifération des lymphocytes T dans les lymphocytes T mémoire.

Remettez en suspension et transférez la moitié des cellules dans de nouveaux puits pour permettre la croissance cellulaire. Ajouter un milieu frais contenant de l’IL-2 ou de l’IL-15 pour maintenir les populations de lymphocytes T différenciés par cytokines en vue d’une analyse ultérieure.

Pour commencer, lavez les billes CD3/CD28 en transférant 12,5 microlitres de billes par million de cellules dans un tube de microcentrifugation et en ajoutant 12,5 microlitres de PBS pour 12,5 microlitres de billes dans le tube. Ensuite, placez le tube de microcentrifugation sur un aimant approprié pendant 1 minute, jetez le tampon et remettez les billes en suspension dans le volume d’origine du milieu à cellules T.

Ensuite, ajoutez 12,5 microlitres de billes par million de cellules à un rapport de 1 à 2 billes par cellules, et divisez les cellules en deux conditions d’environ 5 millions de cellules chacune. Ensuite, ajoutez le volume correct de cytokines à chaque condition et transférez les cellules dans des plaques multi-puits. Incuber les cellules pendant trois jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après trois jours d’incubation, préparez un milieu de cellules T frais avec le double de la concentration de cytokines. Remettez en suspension et divisez les cellules en transférant la moitié du volume de chaque puits dans un nouveau puits. Ensuite, ajoutez le même volume de milieu à cellules T fraîchement préparé dans chaque puits.