Méthode in vitro pour la différenciation des mégacaryocytes et la formation plaquettaire

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Immunologie

0 vues • 5:07 min • July 8th, 2025

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Les mégacaryocytes sont de grandes cellules multinucléées qui donnent naissance aux plaquettes, qui sont essentielles à la coagulation du sang.

Pour produire des plaquettes in vitro, prenez une culture en suspension de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, HSPC, dérivées du sang de cordon ombilical humain.

Ajoutez de la thrombopoïétine et incubez dans des conditions physiologiques. La thrombopoïétine se lie à son récepteur sur les HSPC, déclenchant des événements de signalisation qui conduisent à la différenciation des HSPC en mégacaryocytes immatures.

Les cellules immatures subissent un processus de maturation pour former des mégacaryocytes matures. Les cellules matures sont grandes et contiennent des granules sécrétoires cytoplasmiques. Ils possèdent un noyau polyploïde multilobé et un système de membrane invaginée dans le cytoplasme.

Les mégacaryocytes matures produisent de longues et fines extensions cytoplasmiques - les proplaquettes. Les proplaquettes – plusieurs gonflements de la taille d’une plaquette reliés par de minces ponts cytoplasmiques – sont libérés dans le milieu.

Les ponts cytoplasmiques se rompent, provoquant la libération de plaquettes individuelles. Centrifugeuse pour obtenir les plaquettes sous forme de pastille. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un tampon contenant de l’adénosine diphosphate - pour l’activation plaquettaire - et des anticorps marqués par fluorescence - pour identifier les plaquettes activées.

L’adénosine diphosphate se lie à des récepteurs spécifiques couplés aux protéines G sur les plaquettes. La liaison déclenche une cascade de signalisation, conduisant à l’activation plaquettaire. L’activation induit une signalisation intracellulaire qui active un complexe d’intégrine sur la membrane plaquettaire. Les anticorps marqués par fluorescence se lient au complexe activé.

Analysez les cellules à l’aide de la cytométrie en flux. La présence d’un signal de fluorescence spécifique de l’anticorps indique l’activation des plaquettes.

Pour la différenciation des mégacaryocytes, ensemencer 5 x 105 cellules CD34 positives par millilitre dans 2 millilitres de milieu sans sérum, complétées par de la thrombopoïétine humaine recombinante par puits, dans une plaque à 12 puits pour leur incubation à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans une atmosphère humidifiée.

Aux points temporels appropriés de surveillance de la différenciation, prélever les cellules de deux à trois puits par point temporel sans perturber les cellules des autres puits, et colorer les cellules collectées avec des anticorps anti-CD41 et anti-CD42a pour déterminer le pourcentage de mégacaryocytes matures dans les cultures.

Pour une visualisation microscopique des marqueurs de surface cellulaire, lavez les cellules récoltées dans 1 millilitre de tampon de séparation et remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon frais. Utilisez un cytospin pour ensemencer les cellules sur une lame de verre, et fixez les cellules à la lame avec une immersion de 30 secondes dans du méthanol. Après le séchage à l’air, étiquetez les cellules avec 20 microlitres de milieu de montage complété par DAPI et recouvrez les cellules d’une lamelle pour une visualisation par microscopie fluorescente.

Pour compter les proplaquettes, récoltez les cellules au jour 8 ou 9 de la différenciation, et ensemencez les cellules collectées à raison de 1 x 104 cellules par 200 microlitres de milieu frais sans sérum complété par de la thrombopoïétine humaine recombinante par puits dans une plaque de 48 puits. Après 5 jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, comptez le nombre de mégacaryocytes porteurs de proplaquettes par puits sur un microscope à lumière inversée à l’aide de l’objectif 10 ou 20 fois.

Pour analyser l’activation plaquettaire, au 14e ou 15e jour de culture, mélangez délicatement les cellules à l’aide d’une pipette Pasteur et prélevez 100 microlitres de cellules. Ajoutez 1 millilitre de tampon Tyrode aux cellules et granulez-les par centrifugation. Récupérez le surnageant pour la centrifugation afin de granuler les particules de la taille d’une plaquette, et remettez les particules en suspension dans 100 microlitres de tampon Tyrode frais. Ensuite, marquez les particules avec un anticorps anti-PAC-1. Activez-les avec de l’adénosine diphosphate pendant 20 minutes à température ambiante et analysez le pourcentage d’événements positifs au PAC-1 par cytométrie en flux.

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Dernière mise à jour : 1 août 2026