Système de culture thymique tridimensionnelle pour générer des émigrants thymiques dérivés d’iPSC

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologie

0 vues • 5:06 min • July 8th, 2025

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Pour générer des émigrants thymiques dérivés d’iPSC, les iTE à partir de lymphocytes T immatures dans un système de culture d’organes thymiques 3D, prennent de la désoxyguanosine, des lobes thymiques fœtaux de souris traités par dYUO dans un milieu approprié.

dGUO pénètre dans l’environnement thymique et détruit les lymphocytes thymiques endogènes, empêchant ainsi leur interférence avec les lymphocytes T immatures dérivés d’iPSC pendant la co-culture.

Faites une incision profonde au centre de chaque lobe thymique. Transférez les lobes dans une boîte de culture fraîche contenant un milieu complété par les facteurs de croissance, le facteur de cellules souches, le ligand FLT3 et l’interleukine-7.

Pipeter le milieu contenant le lobe thymique dans les puits d’une plaque de culture 3D. Ajoutez des lymphocytes T immatures dérivés d’iPSC. Couver. Les lymphocytes T migrent dans les lobes thymiques par l’incision.

Dans l’environnement thymique, les facteurs de croissance FLT3 ligand et IL-7 se lient à leurs récepteurs respectifs sur les cellules T immatures, conduisant à l’activation de facteurs de transcription et à l’expression de gènes spécifiques.

Par conséquent, les lymphocytes T immatures subissent une série de changements et acquièrent des caractéristiques spécifiques, pour finalement devenir des lymphocytes T CD8αβ+ qui expriment des molécules CD8, des récepteurs de lymphocytes T et des molécules du CMH de classe I à leur surface.

Retirez les lymphocytes T immatures qui n’ont pas réussi à migrer dans les lobes.

Les iTE matures migrent hors des lobes thymiques, ce qui peut être visualisé comme un motif en forme de halo entourant les lobes au microscope optique.

Le 7e jour du traitement dGUO, sortez quatre nouvelles paraboles de 10 centimètres. Remplissez chaque plat de millilitres de milieu complet. Transférez toutes les membranes de nitrocellulose avec des lobes thymiques dans un plat de 10 centimètres. À l’aide d’une pince, détachez les lobes individuels de la membrane, ce qui leur permet d’être immergés dans le support.

Incuber les lobes pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, transférez les lobes thymiques dans un nouveau plat de 10 centimètres avec un milieu complet, et incubez pendant 1 heure à température ambiante. Répétez ce transfert et cette incubation deux fois de plus.

À l’aide d’une pince, fixez les lobes thymiques à la boîte, tout en utilisant l’autre main pour faire une incision de 100 à 200 micromètres de profondeur au centre, et en étendant la moitié du diamètre du lobe pour faciliter la migration des progéniteurs des lymphocytes T dans le lobe.

Transférez les lobes thymiques dans un nouveau plat de 10 centimètres rempli de milieux de différenciation complets. Si vous utilisez des plaques de culture 3D avec des grilles de niveau inférieur et supérieur, remplissez les deux grilles avec du PBS stérile pour éviter l’évaporation et le séchage des gouttes suspendues.

Ensuite, transférez 30 microlitres de milieu complet contenant un lobe thymique traité au dGUO dans chaque puits de la plaque de culture 3D. Prélever les cellules de la lignée T non adhérentes de la co-culture OP9/DLL1 et remettre les cellules en suspension à une densité de 2 000 à 5 000 cellules de la lignée des cellules T par 20 microlitres de milieu. Ajoutez 20 microlitres de suspension de cellules de la lignée T à chaque lobe thymique de la plaque de culture 3D. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Le lendemain, réglez la pipette P200 sur 30 microlitres. Pipetez le milieu dans chaque puits de haut en bas plusieurs fois, pour enlever toutes les cellules entourant les lobes thymiques. Ensuite, aspirez le média de chaque puits et remplacez-le par 30 microlitres de média complet. Répétez ce processus - pipetage, retrait et remplacement du milieu - 5 à 7 fois pour éliminer tous les lymphocytes T immatures supplémentaires qui ne migrent pas dans les lobes.

Continuez à incuber les lobes en vous assurant de changer 25 à 30 microlitres de milieu par jour. Le jour 4 ou 5, utilisez la microscopie optique pour confirmer la formation d’un halo d’immigrants thymiques dérivés d’iPSC autour des lobes. Collectez quotidiennement les iTEs par des supports de pipetage sans perturbation des lobes. Changez de support tous les jours et poursuivez la collecte jusqu’à environ 12 jours.

Les iTE récoltés sont prêts à être utilisés pour l’analyse moléculaire ou les expériences de transplantation in vivo.

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Dernière mise à jour : 15 août 2026