Expansion ex vivo de cellules tueuses naturelles à partir de cellules mononucléées du sang périphérique

Les cellules tueuses naturelles, NK, sont de gros lymphocytes granulaires qui éliminent les tumeurs et les infections microbiennes.

Pour l’expansion ex vivo des cellules NK, prenez une suspension de cellules mononucléées du sang périphérique, PBMC, contenant une population hétérogène de lymphocytes, y compris des cellules NK. Ajoutez des cellules nourricières irradiées – des cellules lymphoblastoïdes non proliférantes – qui expriment l’interleukine 21 liée à la membrane, mIL-21, nécessaire pour activer et développer les cellules NK.

Ajouter la co-culture dans un puits de culture spécialisé avec une membrane perméable aux gaz au fond, permettant les échanges gazeux. Les cellules se stabilisent et prolifèrent pendant une période prolongée sans nécessiter de passage.

Ajoutez l’interleukine 2, l’IL-2 et l’interleukine 15, l’IL-15 - des cytokines pour la prolifération des cellules NK. Incuber pendant une période adéquate dans des conditions physiologiques.

La mIL-21 sur les cellules nourricières se lie à un récepteur hétérodimérique spécifique sur les cellules NK. L’IL-15 et l’IL-2 exogènes se lient à leurs récepteurs respectifs. La liaison induit différentes voies de signalisation en aval - activant l’expression des gènes - limitant la sénescence cellulaire et conduisant à une prolifération prolongée des cellules NK.

À l’aide de la cytométrie en flux, évaluez l’expansion des cellules NK à intervalles réguliers.

Tracez les données enregistrées pour analyser le taux d’expansion des cellules et leur pureté - croissance sélective du type de cellule NK cible. L’expansion multiple au cours de la période d’incubation indique une prolifération soutenue tout en maintenant une grande pureté.

Lavez séparément les cellules mononucléées du sang périphérique, ou PBMC, et 100 cellules 221-mIL-21 irradiées aux rayons gamma par centrifugation à 400 g pendant 5 minutes avec 10 millilitres de milieu R-10.

Après la centrifugation, enregistrez 1 x 10⁶ PBMC pour la cytométrie en flux, et mélangez 5 x 10⁶ PBMC avec 10 x 10⁶ 100 cellules 221-mIL-21 irradiées aux rayons gamma dans une plaque spéciale à 6 puits. Ajoutez 30 millilitres de milieu R-10 complété par de l’interleukine-2 humaine et de l’interleukine-15 humaine dans la même plaque à 6 puits, et incubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone en remplaçant le média tous les trois à quatre jours.

Pendant l’incubation, notez le nombre total de cellules tueuses naturelles dans le sang périphérique ou PBNK, la viabilité et effectuez une cytométrie en flux tous les trois à quatre jours pour calculer le taux d’expansion des cellules NK.