Reconnaissance de marqueurs CD de cellules tueuses induites par des cytokines humaines par cytométrie en flux

Les cellules CIK sont des populations de cellules immunitaires hétérogènes générées ex vivo à partir de cultures de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) stimulées par des cytokines spécifiques et des anticorps monoclonaux. Les cellules CIK comprennent des populations cellulaires, notamment les cellules NK-T CD3+CD56+, les cellules T CD3+CD56- et les cellules NK CD3-CD56+.

Pour déterminer la proportion de cellules CIK, commencez par utiliser des tubes contenant une suspension de cellules CIK dérivée de PBMC. Ajouter des anticorps anti-CD3 et anti-CD56 conjugués à différents fluorophores et leur mélange dans des tubes désignés. Ajouter des anticorps de contrôle des isotypes conjugués à des fluorophores similaires en tant qu’anticorps spécifiques dans d’autres tubes.

Les anticorps anti-CD3 et anti-CD56 marqués par fluorescence reconnaissent et se lient aux CD3 et CD56 exprimés sur les populations de cellules CIK, respectivement. Les anticorps de contrôle des isotypes n’ont pas de spécificité d’antigène cible, ce qui facilite les mesures non spécifiques du signal de fond.

Pipetez les cellules dans des tubes à fond rond avec des capuchons de crépine de cellules, qui aident à éliminer les agrégats cellulaires. Chargez les tubes dans un carrousel de cytomètre en flux. Pendant la course, chaque cellule passe à travers le canal et rencontre les faisceaux laser, diffusant la lumière.

Un détecteur mesure l’intensité de la lumière diffusée vers l’avant, indicatrice de la taille de la cellule, tandis qu’un autre mesure l’intensité de la lumière diffusée latéralement perpendiculairement au faisceau laser, ce qui suggère une granularité cellulaire. Ensemble, ces informations aident à identifier la population de cellules immunitaires.

Simultanément, des faisceaux laser de longueurs d’onde d’excitation spécifiques excitent les anticorps conjugués aux fluorophores sur les cellules, provoquant des émissions de signaux fluorescents qui sont détectées.

L’analyse d’intensités fluorescentes spécifiques sur les cellules détermine la proportion de sous-populations de cellules CIK.

Commencez cette procédure par la préparation des cellules CIK, comme décrit dans le protocole texte. Ensuite, lavez les cellules CIK avec 10 millilitres de PBS stérile. Centrifuger pendant 10 minutes à 300 fois g et 18 à 20 degrés Celsius. Aspirez le surnageant et remettez en suspension les cellules avec 5 millilitres de PBS. Comptez le nombre de cellules et testez la viabilité des cellules à l’aide du test d’exclusion au bleu de trypan.

Disposez les cellules CIK dans six tubes stériles de 1,5 millilitre à une densité d’environ 0,5 à 1 million de cellules par millilitre de PBS. Étiquetez et traitez les cellules, comme détaillé dans le protocole de texte. Mélangez doucement les cellules CIK avec les anticorps en pipetant doucement de haut en bas au moins trois fois avec une pipette stérile de 1 millilitre. Incuber les cellules pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité.

Centrifugez les tubes pendant 10 minutes à 300 fois g et 18 à 20 degrés Celsius. Après la centrifugation, aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 1 millilitre de PBS. Ensuite, pipetez doucement les cellules de haut en bas au moins trois fois avec une pipette stérile de 1 millilitre. Transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile en polystyrène à fond rond de 5 millilitres avec un capuchon de crépine de cellule en pipetant doucement à travers le bouchon. Ensuite, placez les tubes sur le carrousel dans l’ordre.

Ouvrez le logiciel d’analyse de cytométrie en flux et créez un dossier expérimental. Ensuite, cliquez sur le bouton « Nouvel échantillon » pour ajouter un échantillon et un tube à l’expérience. Nommez les tubes comme indiqué dans le protocole texte.

Pour créer un système de dispersion pour les populations de cellules CIK, sélectionnez d’abord le tube 1 et cliquez sur le bouton Dot Plot pour créer un graphique FSC-A/SSC-A. Tracez une porte rectangulaire sur l’ensemble de la population cellulaire avec un seuil FSC-A supérieur à 5 000 pour exclure les débris cellulaires.

Sélectionnez le paramètre FSC-A/FSC-H pour le nouveau diagramme à points et tracez une porte polygonale autour de toutes les cellules individuelles. Sélectionnez le paramètre count versus FITC conjugué (CD3) et count versus APC (CD56) pour le nouveau tracé d’histogramme. Sélectionnez le paramètre FITC-conjugué (CD3) ou APC-conjugué (CD56) pour le nouveau graphique à points, et dessinez une porte à quatre quadrants pour définir les quatre sous-populations.

Enregistrez les données de 20 000 cellules individuelles dans chaque échantillon. Cliquez sur le bouton « Charger l’échantillon » pour analyser d’abord l’échantillon de contrôle vierge. Identifiez l’ensemble de la population de cellules CIK à l’aide des paramètres des canaux CD56 et CD3. Ouvrez les fichiers contenant les valeurs statistiques de l’échantillon individuel pour analyser les populations de cellules CIK et réimprimez-les dans des fichiers d’analyse.