Dosage pour l’identification de la sécrétion d’interféron gamma dans les organes lymphoïdes murins

L’interféron gamma, ou IFN-γ, une cytokine sécrétée par les lymphocytes T et les cellules tueuses naturelles ou cellules NK, médie la réponse immunitaire contre les agents pathogènes.

Pour étudier in situ la production d’IFN-γ, prenons une souris transplantée avec des lymphocytes T marqués par fluorescence modifiés pour exprimer un récepteur reconnaissant l’ovalbumine – un antigène modèle.

Prenez une suspension de bactéries pathogènes – génétiquement modifiées pour exprimer l’ovalbumine – et injectez-la par voie intraveineuse dans la souris, provoquant une infection systémique. Les bactéries circulantes atteignent la rate – un organe lymphoïde secondaire – qui facilite l’élimination des agents pathogènes en facilitant l’interaction avec les cellules immunitaires.

Les cellules présentatrices d’antigène engloutissent la bactérie et affichent l’antigène. Les lymphocytes T se lient à l’antigène via son récepteur, sont activés et produisent de l’IFN-γ.

Les cellules macrophages, infectées par la bactérie, libèrent des médiateurs immunitaires et régulent à la hausse les ligands activateurs à leur surface. Lors de l’interaction avec ces signaux, les cellules NK sont activées et produisent de l’IFN-γ.

Injecter un inhibiteur du transport intracellulaire des protéines pour restreindre la sécrétion d’IFN-γ, provoquant son accumulation intracellulaire.

Récoltez la rate de souris. Fixez le mouchoir et congelez-le pour faciliter la section. À l’aide d’un cryo-microtome, générez de fines sections de tissus et placez-les sur des lames de verre. Ajoutez des anticorps spécifiques aux cellules NK, qui se lient aux marqueurs de surface, et des anticorps spécifiques à l’IFN-γ, qui colorent l’IFN-γ intracellulaire. Ces anticorps sont marqués avec différents fluorophores.

Placez la lame sous un microscope à fluorescence pour détecter l’IFN-γ à l’intérieur des cellules NK et des cellules T.

Jetez la solution fixatrice et ajoutez 5 millilitres de PBS pendant 5 minutes à température ambiante, sous une légère agitation. Ensuite, remplacez le PBS par 5 millilitres de 30 % de saccharose et incubez pendant 12 à 24 heures pour maintenir la morphologie des tissus. Maintenant, l’orgue coule au fond de la plaque.

Pour congeler l’échantillon, mettez de la glace sèche dans un grand récipient et placez à l’intérieur un récipient plus petit, contenant environ 50 millilitres de méthanol pur et quelques morceaux de glace sèche. Séchez délicatement la rate sur une lingette non pelucheuse. Versez une goutte de composé OCT au fond du moule de base et placez la rate à l’intérieur du moule. Attention à ne pas produire de bulles.

Ajouter environ 1 millilitre d’OCT sur la rate. À l’aide d’une pince, déposez le moule de base à la surface du méthanol dans le bain de glace carbonique, en vous assurant que le méthanol ne touche pas l’OCT. L’OCT s’épaissit et devient blanc lorsqu’il est congelé. N’oubliez pas de congeler le tissu le plus rapidement possible pour minimiser les artefacts.

Sur un cryo-microtome, réglé à la température de moins 21 degrés Celsius. Sectionnez le tissu à l’épaisseur souhaitée autour de 10 micromètres. À l’aide d’un pinceau, prélevez des sections sur des lames de microscope en verre et inspectez-les visuellement. Laissez les sections revenir à température ambiante.

Tracez un cercle avec un bloqueur de liquide, par exemple un stylo PAP, autour de la section de tissu à l’extérieur de l’OCT. Une fois le tissu sec, réhydratez l’échantillon en faisant couler 100 microlitres de PBS sur la section du tissu pendant 5 minutes. Ensuite, retirez le PBS de la section par aspiration et ajoutez 100 microlitres de solution bloquante par section d’échantillon. Incuber dans une chambre humide couverte pendant au moins une heure à température ambiante.

Pour colorer avec des anticorps primaires, remplacez la solution de blocage par le mélange d’anticorps primaires préparé pour chaque échantillon. Incuber pendant quatre heures à température ambiante ou toute la nuit à 4 degrés Celsius dans une chambre humide couverte, avant de laver selon le manuscrit.

Maintenant, diluez les anticorps secondaires d’intérêt à une concentration optimale, généralement 2,5 microgrammes par millilitre dans la solution de blocage. Retirez la solution de lavage final de la section et ajoutez le mélange d’anticorps secondaires préparé sur le dessus de la section, puis incubez pendant une à quatre heures à température ambiante dans une chambre humide et couverte.

Après le lavage avec un tampon de lavage selon le manuscrit, retirez la solution de lavage et effectuez un lavage final avec du PBS. Aspirez la solution saline tamponnée au phosphate et laissez le PBS restant s’évaporer sans que la section ne se dessèche complètement.

Dessinez un cercle autour de la section au dos de la diapositive. Ensuite, placez une goutte du support de montage sur l’échantillon, en vous assurant que le support couvre toute la section, et placez soigneusement un verre de couverture sur le dessus. Laissez les échantillons polymériser pendant la nuit à température ambiante dans l’obscurité.

Le matin, placez la lame sous un microscope à balayage laser spectral inversé. Ajustez les objectifs à 10x/NA 0,40, ou 60x/NA 1,4 pour l’analyse de la localisation subcellulaire des cytokines.