Isolement sélectif de lymphocytes T CD4⁺ Vδ1⁺ γδ à partir de cellules mononucléées de sang périphérique humain

Les lymphocytes T γδ expriment des récepteurs de lymphocytes T, les TCR, comprenant des chaînes gamma et delta avec des domaines variables et constants.

Les lymphocytes T CD4+ Vδ1+ — une sous-population de lymphocytes T γδ — co-expriment la chaîne variable Vδ1 et le corécepteur CD4. Ces cellules migrent dans les tissus enflammés et se transdifférencient en lymphocytes T CD4+ ou CD8+ αβ fonctionnellement matures, médiant ainsi une réponse immunitaire.

Pour isoler les lymphocytes T CD4+ Vδ1+ des cellules mononucléées du sang périphérique humain, les PBMC, les cellules sont remises en suspension dans un tampon. Utilisez un réactif bloquant Fc pour bloquer les récepteurs Fc à la surface cellulaire et empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Ajoutez des anticorps anti-Vδ1 conjugués au fluorophore FITC, qui se lient aux antigènes Vδ1 des lymphocytes T γδ. Incuber avec des microbilles magnétiques couplées à des anticorps anti-FITC, qui se fixent au colorant FITC sur les anticorps liés aux cellules T Vδ1.

Faites passer le mélange à travers une colonne magnétique pour attirer les lymphocytes T Vδ1+ liés aux billes ; les lymphocytes T Vδ1- restent libres et sont ensuite évacués. Rincez de force la colonne en poussant le tampon à travers celle-ci pour détacher les cellules T Vδ1+.

Incuber les cellules à l’aide de billes magnétiques enrobées d’anticorps anti-CD4, qui se lient au corécepteur CD4 des cellules. Placez le tube dans un aimant pour attirer les lymphocytes T CD4+ Vδ1+ liés aux billes ; les lymphocytes T CD4-Vδ1+ restent non liés.

Remettre en suspension les lymphocytes T CD4+ Vδ1+ dans un milieu. Ajoutez un réactif de détachement de billes pour libérer les billes des cellules. Replacez le tube sur l’aimant pour séparer les billes.

Prélever le surnageant de cellules CD4+ Vδ1+ pour une analyse plus approfondie.

Avant de commencer l’isolement des lymphocytes T Vδ1, utilisez une aliquote 1 x 10⁶ du PBMC pour évaluer la fréquence des lymphocytes T Vδ1CD4 positifs dans l’échantillon du donneur par cytométrie en flux. Ensuite, faites tourner le reste des lymphocytes et remettez la pastille en suspension dans 60 microlitres de tampon MACS pour 1 x 10⁷ cellules.

Ensuite, bloquez les cellules dans 20 microlitres de réactif bloquant Fc par 1 x 10⁷ cellules, suivi de l’ajout de 10 microlitres d’anticorps anti-humain Vδ1 conjugué à la FITC par 1 x 10⁷ cellules pendant 12 minutes à 4 degrés Celsius dans l’obscurité. À la fin de l’incubation, lavez les cellules dans 14 millilitres de tampon MACS.

Remettre le granulé en suspension dans 80 microlitres de tampon MACS par 1 x 10⁷ cellules, et ajouter 20 microlitres de microbilles anti-FITC par 1 x 10⁷ cellules avec mélange. Après 15 minutes dans l’obscurité à 4 degrés Celsius, lavez les cellules dans 10 millilitres de tampon MACS frais.

Pendant la centrifugation, équilibrez une colonne magnétique pré-refroidie avec 500 microlitres de tampon MACS. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon MACS, et ajoutez-les soigneusement en haut de la colonne.

Rincez la colonne avec trois lavages tampons MACS de 500 microlitres. Ensuite, retirez la colonne de l’aimant et utilisez un piston pour rincer rapidement les cellules Vδ1-positives avec 1 millilitre de tampon MACS dans un tube conique de 15 millilitres.

Après avoir fait passer les cellules dans une deuxième colonne, vortex 25 microlitres de billes de CD4 pendant 30 secondes. Ensuite, transférez les billes dans un tube réactionnel de 1,5 millilitre, contenant 1 millilitre de tampon MACS, et placez le tube sur un aimant.

Après 1 minute, utilisez une pipette de 200 microlitres pour aspirer soigneusement le surnageant et remettre les billes en suspension dans 25 microlitres de tampon MACS. Ensuite, faites tourner les cellules Vδ1-positives isolées et remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon MACS. Mélangez vigoureusement les cellules avec les billes. Ensuite, après 20 minutes à 4 degrés Celsius, avec une inclinaison constante, replacez le tube sur l’aimant.

Pour éviter de perdre du volume d’échantillon et pour minimiser la présence de cellules CD4 négatives contaminantes, il est essentiel de pipeter tout tampon restant de l’intérieur du couvercle dans le flacon.

Après deux minutes, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, transférez le surnageant contenant des cellules CD4 négatives Vδ1 positives dans un tube frais. Ensuite, retirez les cellules CD4 positives de l’aimant et remettez-les en suspension dans 500 microlitres de tampon MACS.

Après avoir retiré les cellules CD4 négatives deux fois de plus, comme nous venons de le démontrer, incubez les cellules CD4 positives dans 100 microlitres de milieu de culture et 10 microlitres de solution de détachement de billes à température ambiante pendant 45 minutes avec une inclinaison constante. À la fin de l’incubation, remettez les cellules dans l’aimant pendant 1 minute et utilisez une pipette de 200 microlitres pour transférer le surnageant contenant des cellules CD4 positives Vδ1 positives sans billes dans un nouveau tube.

Après avoir retiré les perles restantes deux fois de plus, comme nous venons de le démontrer, faites tourner les cellules. Ensuite, mettez en suspension les cellules CD4 positives Vδ1 dans un milieu frais et préchauffé pour le comptage.