Isolement du réseau de cellules immunitaires gingivales à partir de blocs de dents murines

La gencive, ou tissu gingival, entoure la partie cervicale des dents et l’os de la mâchoire.

Le tissu gingival comprend une couche d’épithélium, séparée du tissu conjonctif sous-jacent par une membrane basale riche en collagène IV. Le tissu conjonctif gingival contient un réseau de cellules immunitaires, notamment des lymphocytes, des mastocytes et des neutrophiles qui protègent la gencive des infections.

Pour isoler le réseau de cellules immunitaires gingivales, prenez des blocs de dents murines contenant du tissu gingival fermement attaché. Traitez les blocs avec un cocktail d’enzymes contenant des collagénases et des DNases de type quatre.

Les collagénases pénètrent dans les tissus, dégradent le collagène-IV et perturbent la membrane basale et l’épithélium gingival, provoquant le déchaussement de la gencive des dents. Pendant ce temps, les DNases dégradent les contaminants de l’ADN. Ajouter un agent chélateur dans le tube ; pour éliminer les cations divalents et empêcher l’agrégation cellulaire.

Transférez les blocs de dents digérés dans une boîte de Pétri contenant un milieu DNase. Extrayez le tissu gingival des blocs dentaires et transférez-le dans une passoire cellulaire.

À l’aide d’un piston, écrasez le mouchoir. Cette dissociation mécanique perturbe la couche conjonctive gingivale, libérant les cellules immunitaires du tissu. Lavez la crépine avec un média et collectez les cellules libérées dans le filtrat.

Centrifuger le filtrat, granuler les cellules et jeter le surnageant contenant les enzymes résiduelles et les débris. Remettre en suspension la population cellulaire transportant les cellules immunitaires dans un milieu complet, prêt pour une analyse future.

Éliminez l’excès de tissu du bord de la gencive et transférez les blocs maxillaire et mandibulaire dans un tube conique de 50 millilitres contenant 5 millilitres de collagénase et de DNase sur de la glace. Digérez le tissu dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 1 heure, en ajoutant 50 microlitres d’EDTA à 0,5 molaire au cours des cinq dernières minutes. Ensuite, ajoutez 5 millilitres de milieu DNase froid aux mouchoirs et mélangez doucement le contenu du tube en remuant. Ensuite, transférez les quatre blocs de tissu dans une boîte de Pétri et couvrez-les de 500 microlitres de milieu DNase frais.

À l’aide d’un scalpel, retirez la gencive de chaque bloc de tissu et transférez tout le contenu de la boîte dans une passoire cellulaire de 70 microns au-dessus d’un tube de 50 millilitres. Lavez la boîte de Pétri et la passoire avec 3 à 5 millilitres de milieu DNase frais, puis utilisez le piston d’une seringue stérile de 3 millilitres pour écraser le tissu gingival contre le grillage de la passoire. Rincer la passoire avec 30 à 35 millilitres de milieu DNase froid, et centrifuger le filtrat. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu complet et déterminez le nombre de cellules viables.