Visualisation intravitale des lymphocytes intra-épithéliales gamma delta

Les lymphocytes intra-épithéliales gamma delta, γδ IEL, sont des lymphocytes T migrateurs spécialisés exprimant des récepteurs de lymphocytes T gamma delta. Ces cellules se trouvent principalement dans l’épithélium intestinal et patrouillent l’épithélium pour limiter la translocation des agents pathogènes dans l’intestin.

Pour visualiser les IEL γδ au sein d’un organisme vivant, commencez par une souris transgénique anesthésiée avec un intestin grêle partiellement exposé. La souris transgénique est génétiquement modifiée pour exprimer des protéines rapporteures – des protéines fluorescentes vertes améliorées – exclusivement en γδ IEL, ce qui permet leur suivi.

À l’aide d’un électrocautérisation, créez une ligne de perforation sur l’intestin grêle exposé le long de la surface antitimerenère, empêchant ainsi les saignements excessifs.

Faites une incision longitudinale sur la ligne de perforation pour exposer la muqueuse intestinale, montrant plusieurs projections en forme de doigt - villosités. Chaque villosité contient des cellules épithéliales avec des IEL γδ résidants qui font saillie dans la lumière intestinale.

Positionnez la souris avec la surface muqueuse exposée directement en contact avec le colorant fluorescent, conférant une fluorescence rouge à la lumière.

Imagez la souris sous un microscope confocal. Localisez une villosité et imagez-la dans différents plans focaux le long de l’axe z, en commençant par l’épithélium de l’extrémité de la villosité. Combinez ces sections optiques pour produire une image 3D.

L’imagerie intravitale montre le mouvement dynamique des IEL γδ en fluorescence verte le long de la membrane basale de la cellule épithéliale près de la lumière rouge.

En plaçant deux paires de pinces de chaque côté du mésentère sous-jacent entre les vaisseaux sanguins, frottez doucement les extrémités des pinces ensemble pour créer un trou dans la membrane. À l’aide d’une pince coudée et d’une aiguille incurvée à pointe effilée fixée à une suture de 5 centimètres, pénétrez un côté du péritoine à travers le trou de la membrane et vers le haut à travers l’autre côté de la muqueuse péritonéale, en plaçant une suture en haut et une autre près du bas de l’incision pour fermer l’incision tout en gardant l’anse de l’intestin extériorisée.

Pour augmenter les chances de succès, n’attachez pas ou ne déchirez aucun vaisseau sanguin lors de la mise en place de la structure abdominale et limitez toute manipulation étrangère de l’intestin.

Ensuite, fermez la peau sous l’anse intestinale de la même manière, en plaçant une suture au milieu de l’incision entre les sutures précédentes dans le péritoine sous-jacent. À l’aide d’un électrocautérisation, faites une ligne de perforation le long de la bordure anti-mésentérique et appliquez immédiatement quelques gouttes d’eau à la surface de l’intestin pour éviter des dommages tissulaires supplémentaires induits par la chaleur.

Épongez avec un Kimwipe pour éliminer l’eau résiduelle. Utilisez des ciseaux Vannas pour découper une fente horizontale d’environ 1,5 centimètre au bord distal du tissu cautérisé, le long de la ligne cautérisée vers l’extrémité proximale du segment de tissu extérisé. Lorsque la surface de la muqueuse est exposée, couvrez l’abdomen avec un Kimwipe humide pour garder le tissu hydraté.

Pour l’imagerie par microscopie confocale à disque rotatif, transportez la souris au microscope dans un récipient couvert. Lancez le logiciel d’imagerie, inclinez la tête du microscope vers l’arrière et ajoutez 150 microlitres de colorant AlexaFluor de 1 micromolaire dans la solution saline tamponnée de Hank sur le fond en verre. Positionnez la souris de manière à ce que la surface muqueuse ouverte entre directement en contact avec la lamelle.

Placez la souris et la parabole sur la platine d’imagerie dans un incubateur préchauffé. Réglez l’intensité d’excitation et le temps d’exposition de chaque laser sur un maximum de 10 à 15 milliwatts et de 120 à 150 millisecondes respectivement, et ajustez la moyenne d’image à « 2 ».

Activez la fonction de gain multiplicateur d’électrons pour réduire le bruit de fond et sélectionnez l’étalonnage de l’objectif 63X pour assurer une mesure correcte de la taille des pixels. À l’aide du laser de 405 nanomètres et de l’objectif aérien 20x, visualisez manuellement les noyaux pour localiser un champ de villosités qui manquent de mouvement notable ou qui dérivent, en évitant les zones de mouvement artificiel dues à la respiration, au péristaltisme ou au rythme cardiaque.

À l’aide du balayage XY, enregistrez la coordonnée x-y du champ d’intérêt et passez à l’objectif d’immersion glycérol 63X. Acquérez une image en direct sur le canal 405 nanomètres pendant 1 minute maximum pour confirmer que les villosités du champ sélectionné sont stables, tout en ajustant la mise au point pour trouver le plan orthogonal juste en dessous de la pointe villeuse.

Ensuite, acquérez des empilements Z en commençant juste en dessous de l’épithélium de l’extrémité des villosités, environ 15 à 20 micromètres, jusqu’aux villosités, jusqu’à ce qu’il soit difficile de résoudre les noyaux en utilisant des pas de 1,5 micromètre. 3 à 5 minutes après le début de l’acquisition, confirmez la stabilité de l’image et la motilité des cellules intra-épithéliales gamma-delta, et continuez à acquérir des images pendant 30 à 60 minutes pour chaque champ de villosités.