Marquage des lymphocytes T auxiliaires murins à l’aide d’anticorps monoclonaux radiomarqués
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 3:28 min • July 8th, 2025
Pour radiomarquer les lymphocytes T murins auxiliaires, les lymphocytes Th porteurs d’un récepteur des lymphocytes T, TCR, spécifiques du peptide d’ovalbumine de poulet, prennent un tube contenant des anticorps monoclonaux radiomarqués, mAbs, avec l’activité radioactive souhaitée.
L’AcM comprend un AcM murin spécifique du TCR exprimé sur la membrane des lymphocytes Th murins. Un chélateur conjugue l’Acm et un isotope de cuivre émetteur de positrons, formant un complexe stable.
Diluez les anticorps monoclonaux radiomarqués avec une solution saline. Ensuite, ajoutez les anticorps monoclonaux radiomarqués dilués dans une plaque multipuits contenant une suspension de lymphocytes Th. Incuber brièvement.
Au sein de la culture, les anticorps monoclonaux radiomarqués se lient aux TCR sur les membranes des lymphocytes Th. Après l’incubation, transférez la suspension cellulaire dans un tube frais.
centrifugeuse. Jetez le surnageant contenant des anticorps radiomarqués non liés. Remettre en suspension les lymphocytes Th dans le milieu et les transférer dans une plaque multi-puits. Incuber pour une durée prolongée.
La liaison mAb-TCR radiomarquée provoque le recrutement de protéines adaptatrices du côté cytoplasmique de la membrane plasmique, à laquelle les triskels de clathrine se lient et forment une fosse recouverte de clathrine.
Les protéines accessoires aident à pincer la vésicule de la membrane plasmique, facilitant l’internalisation du complexe mAb-TCR radiomarqué dans le cytoplasme. Finalement, les TCR sont réexprimés sur les membranes des lymphocytes Th.
Les lymphocytes Th radiomarqués sont prêts pour d’autres expériences.
Pour le radiomarquage des cellules TH1 spécifiques de l’ovalbumine de poulet, utilisez d’abord un calibrateur de dose pour aspirer 37 mégabecquerels de l’anticorps radioactif spécifique des cellules T d’intérêt, dans une seringue sans volume mort.
Ensuite, distribuez l’anticorps dans une coupelle de réaction, puis mesurez et soustrayez la quantité restante de réactivité dans la seringue de la quantité qui a été prélevée. Ensuite, ajoutez un millilitre de solution saline dans la tasse pour générer une solution de 37 mégabecquerel par millilitre.
Ensuite, ajoutez deux fois 10 à la sixième cellule OVA-TH1 dans 0,5 ml de milieu complet à chaque puits d’une plaque de 48 puits, suivi de 20 microlitres de solution d’anticorps radiomarqués. Après 30 minutes dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et à 7,5 % de dioxyde de carbone, regroupez les cellules radiomarquées dans un tube conique de 50 millilitres pour deux lavages dans 10 millilitres de PBS à 37 degrés Celsius.
Aperçu
Cet article décrit une méthode de radiomarquage de lymphocytes T helper murins exprimant un récepteur de cellule T spécifique du peptide d'ovalbumine de poulet. Le processus implique l'utilisation d'anticorps monoclonaux radiomarqués afin de faciliter l'internalisation du complexe TCR dans le cytoplasme des lymphocytes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Immunologie
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les lymphocytes T helper jouent un rôle crucial dans la réponse immunitaire.
- Les techniques de marquage radioactif sont essentielles pour le suivi et l'étude des interactions cellulaires.
- La compréhension de la dynamique du TCR peut fournir des informations sur la fonction immunitaire.
- L'ovalbumine de poulet est un antigène modélisateur utilisé dans les études immunologiques.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable de radiomarquage des lymphocytes T auxiliaires.
- Étudier le processus d'internalisation des récepteurs des lymphocytes T (TCR) après liaison avec des anticorps radiomarqués.
- Préparer des lymphocytes T auxiliaires radiomarqués pour des applications expérimentales ultérieures.
Méthodes utilisées
- Préparation d'anticorps monoclonaux marqués au radionucléide spécifiques des récepteurs T (TCR).
- Incubation des lymphocytes T helper avec les anticorps marqués au radionucléide.
- Centrifugation pour éliminer les anticorps non liés.
- Resuspension des cellules en vue d'expériences ultérieures.
Résultats principaux
- Liaison réussie d'Ac monoclonaux radiomarqués aux TCR sur les lymphocytes Th.
- Internalisation du complexe Acm-TCR dans le cytoplasme.
- Re-expression des TCR à la surface des membranes des lymphocytes après internalisation.
- Préparation de lymphocytes Th radiomarqués pour des études ultérieures.
Conclusions
- La méthode marque efficacement les lymphocytes Th pour le suivi et l'analyse.
- Les connaissances acquises grâce à cette étude peuvent améliorer la compréhension de la dynamique des lymphocytes T.
- Cette technique peut être appliquée dans divers contextes de recherche immunologique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
Le marquage radioactif de lymphocytes T auxiliaires murins à l'aide d'anticorps monoclonaux permet un suivi précis et non invasif de la circulation des cellules immunitaires par imagerie TEP/TDM. Cette capacité soutient la validation précoce des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans la découverte de médicaments axée sur l'immunologie. Cette approche renforce la confiance prédictive des stratégies de modulation immunitaire et éclaire les décisions portant sur les portefeuilles de recherche en immuno-oncologie et en auto-immunité.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet la visualisation directe du trafic des lymphocytes T spécifiques des antigènes in vivo pour la vérification d'hypothèses.
- Permet la validation fonctionnelle des cibles immunitaires en surveillant l'engagement et l'internalisation du TCR.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en clarifiant la réponse cellulaire à la liaison d'anticorps.
- Améliore la fiabilité prédictive des stratégies de modulation des voies immunitaires.
Développement de tests et criblage
- Offre une méthode normalisée pour générer des cellules immunitaires marquées au radionucléide destinées à des tests en aval.
- Garantit la reproductibilité et l'évaluation quantitative des interactions anticorps-cellule.
- Permet la préparation de populations cellulaires validées pour des plateformes de criblage basées sur l'imagerie.
- Facilite une évaluation fiable des effets des composés sur la migration des cellules immunitaires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats d'imagerie préclinique avec la dynamique des cellules immunitaires pertinente pour la maladie.
- Permet une continuité entre la validation in vitro et le suivi in vivo dans les modèles animaux.
- Prend en charge l'avancement des candidats ciblant le système immunitaire avec ajustement du risque.
- Fournit des données translatables sur les biomarqueurs de localisation et de persistance des cellules immunitaires.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode de radiomarquage s'intègre dans la continuité découverte-préclinique, soutenant à la fois les études mécanistiques précoces et les flux de travail d'imagerie translationnelle.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification fondée sur des hypothèses du ciblage et du trafic des récepteurs des lymphocytes T.
- Tri : Assure un marquage cellulaire reproductible et quantitatif pour les tests basés sur l'imagerie.
- Analytique : Fournit des lectures en TEP/TDM pour comparer la distribution des cellules immunitaires selon différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie la validation in vitro au suivi in vivo des cellules immunitaires dans des modèles précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour le radiomarquage de diverses populations de cellules immunitaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive dans les études sur le ciblage et la migration des cellules immunitaires.
- Valeur opérationnelle : Standardise les protocoles de radiomarquage et d'imagerie pour l'analyse des cellules immunitaires.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions de poursuite ou d'abandon pour les thérapeutiques immunomodulatrices.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des actifs en immunologie et en immuno-oncologie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en radiochimie et en manipulation des cellules immunitaires.
- Exige un accès à une infrastructure d'imagerie TEP/TDM et de calibration de dose.
- Implique une standardisation interéquipes pour le marquage cellulaire et l'imagerie reproductibles.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les types de cellules immunitaires ou les cibles réceptrices.
- Des protocoles de sécurité radiologique et une conformité réglementaire sont essentielles.
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Dernière mise à jour : 22 août 2026