Une technique in vitro pour différencier les cellules T auxiliaires productrices de GM-CSF des cellules T naïves

Facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages, le GM-CSF est sécrété par les cellules T auxiliaires productrices de GM-CSF ou les cellules T_HGM. Ces cellules présentent une faible expression d’autres cytokines spécifiques des lymphocytes T auxiliaires.

Pour commencer la différenciation in vitro des cellules T_HGM, prenez une suspension de cellules T auxiliaires – isolée de la rate de souris – contenant des cellules matures activées par l’antigène et des cellules naïves indifférenciées.

Ajoutez des anticorps marqués par fluorescence ciblant les marqueurs de surface caractéristiques des cellules naïves et matures. Effectuez un tri cellulaire activé par fluorescence pour isoler les lymphocytes T naïfs.

Plaquez les cellules dans un puits recouvert d’anticorps qui se lient au complexe récepteur des lymphocytes T. Ajoutez un anticorps qui se lie au récepteur de co-stimulation. La liaison synergique active les cellules.

Ajoutez de l’interleukine 7 – une cytokine – induisant la différenciation en cellules T_HGM et la production de GM-CSF. Ajoutez de l’acétate de myristate de phorbol, du PMA - un composé pro-inflammatoire, de l’ionomycine - un ionophore de calcium et un inhibiteur du transport des protéines.

La PMA pénètre dans la cellule et active une protéine kinase. L’ionomycine perméable à la membrane transfère les ions calcium à l’intérieur de la cellule, augmentant ainsi la concentration intracellulaire de calcium.

L’activation de la protéine kinase et un taux élevé de calcium déclenchent des signaux qui restimulent les cellules T_HGM, ce qui entraîne une production plus élevée de GM-CSF. L’inhibiteur du transport des protéines bloque la sécrétion de GM-CSF, facilitant la détection intracellulaire.

Effectuez une coloration par immunofluorescence, détectez les cytokines intracellulaires et analysez les cellules à l’aide de la cytométrie en flux. La majorité des cellules présentant des niveaux élevés de GM-CSF mais une faible expression des autres cytokines indiquent une différenciation réussie en cellules T_HGM.

Pour isoler les lymphocytes T CD4 positifs, remettez en suspension la pastille de globule blanc dans 5 millilitres de tampon d’isolement cellulaire et filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire de 30 micromètres dans un nouveau tube de 15 millilitres pour éliminer tous les débris. Après le comptage, remettre les cellules en suspension à une concentration de tampon de 1 x 10⁷ cellules par 90 microlitres, et ajouter 10 microlitres de billes magnétiques conjuguées anti-CD4 pour 1 x 10⁷ cellules pour une incubation de 15 minutes à 4 degrés Celsius, avec mélange toutes les 5 minutes.

Pendant que les cellules sont en incubation, placez une colonne de séparation sur un support magnétique et pré-mouillez la colonne avec 2 millilitres de tampon. Ensuite, lavez les cellules avec 5 millilitres de tampon et remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de tampon. Chargez l’échantillon sur la colonne et collectez la fraction CD4 négative dans un tube conique de 15 millilitres.

Lorsque toutes les cellules sont passées dans la colonne, lavez le réservoir trois fois avec 1 millilitre de tampon par lavage avant qu’il ne sèche. Après le dernier lavage, transférez la colonne dans un nouveau tube conique de 15 millilitres et plongez la colonne avec 2 millilitres de tampon d’isolement cellulaire pour expulser la fraction de bille positive. Ensuite, collectez les cellules CD4 positives par centrifugation.

Pour le tri cellulaire activé par fluorescence des lymphocytes T naïfs, remettre en suspension la pastille de cellules CD4 positives triée par billes dans 500 microlitres de tampon et mélanger les cellules avec un cocktail d’anticorps conjugués à la fluorescence approprié. Après 20 à 30 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière, lavez les cellules dans 5 millilitres de tampon frais, et remettez en suspension la pastille dans 500 microlitres de tampon frais.

Filtrez les cellules à travers un treillis en nylon et transférez les cellules dans un tube FACS précodé avec 500 microlitres de tampon. Gate pour sélectionner les populations de ligands CD4 positifs, CD25 négatifs et CD44 à faible CD62 à cellules élevées. Ensuite, triez les fractions de lymphocytes T CD4 positifs, CD25 négatifs, CD-44 faibles, CD-62 élevés dans un nouveau tube à centrifuger de 15 millilitres et granulez les lymphocytes T CD4 positifs naïfs isolés par centrifugation.

Pour la différenciation des lymphocytes T auxiliaires par le facteur de stimulation des colonies de granulocytes et de macrophages, ou GM-CSF, remettre en suspension les lymphocytes T triés à une concentration de 1 x 10⁶ cellules par millilitre dans un milieu RPMI complet contenant 50 micromolaires de bêta-mercaptoéthanol, et aspirer l’anticorps epsilon anti-CD3 de chaque puits d’une plaque précodée à 48 puits.

Ensuite, ensemencez 2,5 x 10^cellules 5 dans chaque puits avec de l’IL-7, de l’anti-CD28 et de l’anti-IFN gamma, et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO₂ pendant trois jours. Le troisième jour de culture, utilisez un microscope pour vérifier la différenciation cellulaire et récoltez les cellules pour la centrifugation.

Remettez le granulé en suspension dans un milieu RPMI complet frais pendant deux lavages, en remettant les cellules en suspension dans 1 millilitre de milieu complet frais après le deuxième lavage pour le comptage. Divisez les cellules en trois volumes égaux et stimulez à nouveau la première aliquote de cellules avec de la PMA et de l’ionomycine en présence d’un inhibiteur de transport de protéines pendant 4 à 6 heures.

À la fin de la stimulation, récoltez les cellules pour les colorer avec des anticorps anti-CD4. Après 30 minutes, fixez les cellules avec 200 microlitres de tampon de fixation pendant 20 à 60 minutes, suivi de deux lavages dans 1 millilitre de tampon de perméabilisation par lavage. Ensuite, colorez pour l’expression des cytokines intracellulaires pendant 30 minutes dans l’obscurité.