Surveillance de la dynamique de recrutement des neutrophiles et de la charge bactérienne au site d’infection dans un modèle murin

Pour surveiller le recrutement des neutrophiles – des cellules immunitaires essentielles qui facilitent l’élimination bactérienne, commencez par une souris anesthésiée, transgénique et immunodéprimée avec une blessure exposant le tissu conjonctif de son dos.

Les neutrophiles de la souris transgénique expriment une protéine fluorescente verte améliorée, ce qui facilite le suivi des neutrophiles. De plus, leur capacité altérée à tuer les bactéries rend la souris plus sensible aux infections.

Prenez un inoculant bactérien génétiquement modifié possédant une bioluminescence – des caractéristiques d’émission de lumière.

Injectez l’inoculum bactérien sur le site blessé, en assurant sa livraison entre le tissu conjonctif et le fascia - une couche de tissu fibreux sous le tissu conjonctif. Au site d’injection, les bactéries prolifèrent et colonisent, provoquant une infection des tissus.

En réponse à l’infection, les cellules immunitaires libèrent des chimiokines – des molécules de signalisation chimique qui attirent les neutrophiles. Les neutrophiles migrent rapidement par chimiotaxie – mouvement induit par des produits chimiques – et extravasent à travers les vaisseaux sanguins dans les tissus à proximité de l’infection bactérienne.

Imagez la souris pour les signaux de bioluminescence et de fluorescence, représentant respectivement la charge bactérienne et les neutrophiles recrutés.

Au fil du temps, une augmentation des signaux de bioluminescence et de fluorescence est corrélée à l’augmentation de la charge bactérienne et au recrutement continu de neutrophiles sur le site d’infection.

Pour l’inoculation du staphylocoque doré, remplissez une seringue d’insuline de calibre 28 avec 50 microlitres de l’inoculant bactérien bioluminescent préparé, et utilisez un doigt pour tirer le derme de l’animal blessé sur le côté. En tenant la seringue presque parallèle au tissu, insérez-la lentement dans le tissu jusqu’à ce qu’une diminution soudaine de la résistance se fasse sentir, indiquant un perçage du fascia.

Avec l’aiguille placée au centre de la plaie, délivrez lentement tout le volume de l’inoculant. Confirmez que l’inoculant forme une bulle au centre de la plaie avec une fuite ou une dispersion minimale, et retirez lentement la seringue de l’animal. Ensuite, retournez l’animal dans sa cage avec chaleur et surveillance, jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement.

Après une blessure et une infection, et tous les jours pendant l’expérience, placez la souris anesthésiée dans un imageur bioluminescent et à fluorescence avec la plaie aussi plate que possible. Dans le logiciel de l’imageur, sélectionnez Luminescence et Photographie comme modes d’imagerie. Le temps d’exposition doit être préréglé sur 1 minute pour le petit binning, F/stop 1 pour la luminescence, F/stop 8 pour la photographie et ouvert pour le filtre d’émission. Cliquez ensuite sur Acquérir pour enregistrer l’image.

Pour l’imagerie de fluorescence in vivo, sélectionnez Fluorescence et Photographie comme modes d’imagerie. Le temps d’exposition doit être préréglé à 1 seconde pour le petit binning, F/stop 1 pour la fluorescence, F/stop 8 pour la photographie et les longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 465 sur 30 nanomètres et 520 sur 20 nanomètres avec une intensité de lampe élevée respectivement. Cliquez ensuite sur Acquérir pour enregistrer l’image.

Après avoir obtenu les deux séries d’images, retournez l’animal dans sa cage avec surveillance jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement.

Pour l’analyse d’image, ouvrez l’image à quantifier dans un logiciel d’analyse d’image approprié, et placez la région circulaire d’intérêt par défaut sur toute la zone de la plaie, y compris la peau environnante. Cliquez sur Mesurer la région d’intérêt et enregistrez les valeurs du flux moyen de la plaie afin de permettre le tracé du flux moyen de chaque signal en fonction du temps.

Pour mesurer la cicatrisation de la plaie, placez une région circulaire d’intérêt sur le bord de la plaie et mesurez la zone de la plaie en centimètres carrés pour permettre de tracer la variation fractionnée par rapport à la ligne de base en fonction du temps.