Identification des inhibiteurs de kinases qui modulent la réponse des thymocytes à de forts signaux TCR

Commencez avec des cellules thymocytaires de souris dans une plaque multi-puits. Ajouter des billes magnétiques recouvertes d’anticorps anti-CD3 et anti-CD28. À un sous-ensemble de puits, ajoutez une concentration appropriée de l’inhibiteur de kinase testé. Couver.

Les anticorps se lient aux récepteurs CD3 et CD28 de surface cellulaire sur les thymocytes doublement positifs et les activent, provoquant une régulation négative des récepteurs des lymphocytes T, des TCR et l’activation de la protéine kinase cytosolique.

Ces protéines kinases activent les voies de signalisation en aval, conduisant à une augmentation de l’expression de CD69 à la surface cellulaire et à l’activation cytosolique de la caspase-3. La caspase-3 activée clive les protéines cellulaires essentielles, initiant l’apoptose des thymocytes.

Dans les cellules traitées avec l’inhibiteur de kinase, les inhibiteurs bloquent les kinases cytosoliques, modulant l’expression de CD69 et l’activation de la caspase-3.

Pipetez dans un cocktail d’anticorps marqués au fluorophore qui se lie aux corécepteurs TCR, CD4 et CD8 et aux récepteurs CD69 des thymocytes. Traitez les thymocytes avec un tampon pour les fixer et les perméabiliser.

Incuber avec un anticorps anti-caspase-3 marqué au fluorophore qui se lie à la caspase-3 cytosolique. Analysez les thymocytes à l’aide de la cytométrie en flux.

Les thymocytes témoins doublement positifs expriment les marqueurs fluorescents de surface cellulaire CD4, CD8 et CD69 et la caspase-3 intracellulaire et montrent une régulation négative du TCR. En revanche, les thymocytes traités par inhibiteur présentent des niveaux plus faibles de CD69 fluorescents et de caspase-3.

Pour commencer le traitement des thymocytes avec des inhibiteurs de kinases, utilisez une pipette multicanaux pour ajouter 40 microlitres par puits de thymocytes dans une plaque de petit volume. Mettez l’assiette sur de la glace. Ensuite, pipetez une partie des inhibiteurs de kinases, DMSO et dexaméthasone, et quatre parties du milieu RPMI complet dans une plaque à 96 puits.

Désigner huit puits de la plaque de petit volume aux témoins non traités, quatre puits aux témoins positifs traités à la dexaméthasone pour la mort cellulaire, en ajoutant la dexaméthasone diluée à la concentration de 5 micromolaires, et quatre puits aux témoins traités par véhicule en ajoutant 0,5 microlitre de DMSO dilué. Ensuite, à partir des puits correspondants de la plaque inhibitrice, ajoutez 0,5 microlitre de chaque inhibiteur dilué à la plaque de 96 puits.

Pour commencer la stimulation des thymocytes, assurez-vous d’abord que les billes anti-CD3 et CD28 sont uniformément remises en suspension. Ensuite, lavez 1 millilitre de perles avec 2 millilitres de tampon PBS. Placez le tube sur un support magnétique pour séparer les billes du surnageant et aspirez la solution. Ensuite, remettez les billes en suspension dans 1 millilitre du milieu RPMI complet.

Ajouter 10 microlitres par puits de suspension de billes à chaque échantillon traité par inhibiteur, aux quatre échantillons traités au DMSO et à quatre des 8 échantillons non traités. Ajoutez 10 microlitres de l’IPRP complet aux quatre puits non traités restants.

Utilisez un agitateur orbital à microplaques pour agiter doucement la plaque. Ensuite, incubez les thymocytes dans un environnement à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone pendant 17 à 20 heures ou toute la nuit.

Amorcez un laveur automatisé de plaques à flux laminaire, d’abord avec 150 millilitres de solution d’éthanol-Tween, puis avec de l’eau désionisée complétée par 1 % de Tween-20, et enfin, avec un tampon de lavage FACS. À la fin de l’incubation, à l’aide du système de lavage de plaques, lavez la plaque avec un tampon de lavage FACS en utilisant un cycle de lavage neuf fois. Chaque lavage ajoute et élimine 55 microlitres de tampon de lavage par flux laminaire, ce qui entraîne une dilution exponentielle des réactifs dans les puits.

Pour colorer les antigènes de surface, diluez d’abord un volume unitaire d’anticorps anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 et anti-CD69 dans 100 volumes unitaires de tampon de lavage FACS. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 25 microlitres du mélange d’anticorps colorants. Utilisez un agitateur orbital à microplaques pour agiter doucement la plaque, puis laissez la plaque sur de la glace pendant 30 minutes.

Pour fixer les cellules, lavez d’abord la plaque avec 55 microlitres de tampon de lavage FACS en utilisant neuf cycles de lavage comme décrit précédemment. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de tampon de fixation et de perméabilisation dans chaque puits. Mélangez bien et incubez l’assiette sur de la glace pendant 30 minutes. Après l’incubation, préparez un tampon 1x perm/wash en diluant 25 millilitres du stock 10x fourni dans 225 millilitres d’eau ultra-pure.

Amorcez le lave-plaques avec 1x tampon et lavez la plaque avec 55 microlitres du 1x tampon en utilisant un cycle de lavage neuf fois comme décrit précédemment. Mélangez 1 millilitre d’anticorps anti-caspase-3 avec 2 millilitres de 1x perm et tampon de lavage. Ajouter 25 microlitres par puits du mélange dans les cellules fixes.

Utilisez un agitateur orbital à microplaques pour agiter doucement la plaque. Laissez l’assiette sur de la glace pendant une heure. À la fin de l’incubation, répétez l’étape de lavage, neuf fois avec la perm 1x et le tampon de lavage. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de tampon de lavage FACS dans tous les puits de la plaque, pipetez de haut en bas plusieurs fois pour mélanger la solution.

Enfin, transférez les échantillons mélangés dans des tubes de microtitration. Remplissez les tubes avec le tampon de lavage FACS jusqu’à un volume total de 200 microlitres et procédez à l’analyse par cytométrie en flux.