Identification des inhibiteurs de kinases qui modulent la réponse des thymocytes à de forts signaux TCR

Commencez avec des cellules thymocytaires de souris dans une plaque multi-puits. Ajouter des billes magnétiques recouvertes d’anticorps anti-CD3 et anti-CD28. À un sous-ensemble de puits, ajoutez une concentration appropriée de l’inhibiteur de kinase testé. Couver.

Les anticorps se lient aux récepteurs CD3 et CD28 de surface cellulaire sur les thymocytes doublement positifs et les activent, provoquant une régulation négative des récepteurs des lymphocytes T, des TCR et l’activation de la protéine kinase cytosolique.

Ces protéines kinases activent les voies de signalisation en aval, conduisant à une augmentation de l’expression de CD69 à la surface cellulaire et à l’activation cytosolique de la caspase-3. La caspase-3 activée clive les protéines cellulaires essentielles, initiant l’apoptose des thymocytes.

Dans les cellules traitées avec l’inhibiteur de kinase, les inhibiteurs bloquent les kinases cytosoliques, modulant l’expression de CD69 et l’activation de la caspase-3.

Pipetez dans un cocktail d’anticorps marqués au fluorophore qui se lie aux corécepteurs TCR, CD4 et CD8 et aux récepteurs CD69 des thymocytes. Traitez les thymocytes avec un tampon pour les fixer et les perméabili