Activation de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris en réponse à des anticorps

Après l’exposition à des agents pathogènes, les macrophages subissent une activation et libèrent des cytokines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires, coordonnant ainsi la réponse du système immunitaire.

Pour étudier in vitro l’activation des macrophages dérivés de la moelle osseuse, transférez une suspension isolée de cellules de moelle osseuse de souris dans un flacon de culture. Incuber brièvement.

Les cellules mésenchymateuses, les monocytes et les macrophages matures adhèrent à la surface du ballon tandis que les progéniteurs hématopoïétiques restent en suspension.

Prélever le milieu contenant les progéniteurs hématopoïétiques et centrifuger. Transférez les cellules remises en suspension dans le milieu du facteur de stimulation des colonies de macrophages, M-CSF, dans une fiole de culture.

Le M-CSF provoque la différenciation de la sous-population de progéniteurs myéloïdes en macrophages, qui apparaissent ramifiés et adhèrent au flacon.

Jetez le milieu contenant des cellules non adhérentes. Ajoutez le milieu M-CSF et incuber. Une fois que les macrophages atteignent leur état pleinement fonctionnel, récoltez-les. Centrifugeuse.

Macrophages sur plaques remis en suspension dans un milieu de M-CSF dans des puits à plaques multipuits. Après l’adhérence des macrophages aux puits, ajoutez des immunoglobulines polyclonales humaines et du lipopolysaccharide bactérien, LPS, une toxine.

Les immunoglobulines se lient à des récepteurs FCγ spécifiques, tandis que le LPS se lie à des récepteurs de type Toll sur les macrophages. Cette co-stimulation entraîne l’activation des macrophages anti-inflammatoires via des cascades de signalisation en aval, provoquant la libération de niveaux élevés de cytokines anti-inflammatoires et de faibles niveaux de cytokines pro-inflammatoires.

Prélever le milieu contenant des cytokines pour une analyse plus approfondie afin de confirmer l’activation des macrophages.

Fixez une souris euthanasiée en décubitus dorsal sur une planche de mousse avec ses membres tendus, puis nettoyez les pattes avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, faites une coupe peu profonde d’environ 2 millimètres pour enlever la peau et la fourrure de la surface de chaque patte arrière. Ensuite, disséquez les tissus pour accéder aux tibias et aux fémurs.

Pour enlever les tibias et les fémurs, coupez l’os et les muscles juste en dessous de l’articulation de la hanche et au-dessus des chevilles. Ensuite, retirez autant de tissu musculaire que possible des os. Ensuite, nettoyez les os avec de l’éthanol à 70 % et laissez-le s’évaporer pendant 1 minute, puis placez les os dans une plaque à 6 puits remplie de milieu de rinçage des os.

Dans la plaque, coupez 1 millimètre de chaque extrémité des fémurs afin que leurs cavités internes soient exposées. Assurez-vous qu’une aiguille de calibre 26 peut accéder aux cavités. Ensuite, séparez le tibia et le fémur de l’articulation du genou. Ensuite, insérez l’aiguille attachée à une seringue de 10 millilitres dans une cavité osseuse et prélevez la moelle osseuse.

Regrouper la moelle osseuse des 4 os dans un tube conique de 50 millilitres avec 5 millilitres de milieu de rinçage osseux. Pipetez le milieu et la moelle de haut en bas plusieurs fois, ou vortex à vitesse lente pour disperser doucement les amas dans la suspension. Les chaînes de moelle doivent être brisées en petites taches de moelle de moins d’un demi-millimètre de long.

Ensuite, remplissez le tube à 50 millilitres avec un milieu de rinçage osseux et transférez-le dans une fiole de culture tissulaire de 75 centimètres carrés. Incuber la moelle osseuse pendant une heure. Pendant l’incubation, les cellules matures adhéreront au ballon et les progéniteurs hématopoïétiques souhaités resteront en suspension. Transférez la suspension dans un tube conique de 50 millilitres et faites tourner les cellules en une pastille.

Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 5 millilitres de milieu de culture MCSF. Ensuite, ajustez la densité des cellules à 500 000 par millilitre et chargez 30 millilitres dans un nouveau flacon de 75 centimètres carrés. Poursuivez la culture des cellules et, aux jours 4, 7 et 10, vérifiez qu’elles sont adhérentes et légèrement ramifiées à l’aide d’un microscope à fond clair à contraste de phase inversé.

Lors de la vérification des cellules, jetez le milieu contenant les cellules non adhérentes. Ensuite, lavez une fois les cellules adhérentes avec de l’IMDM et ajoutez 30 millilitres de milieu de culture MSCF frais dans le flacon. Le 10e jour, remplacez le milieu par 8 millilitres de tampon de dissociation cellulaire à base d’EDTA sans enzyme pour collecter les cellules. Incuber brièvement les cellules, puis gratter doucement les cellules et vérifier qu’elles ont été libérées à l’aide d’un microscope.

Une fois les cellules libérées, transférez le tampon avec les cellules dans un tube conique de 50 millilitres, puis rincez le ballon trois fois avec 5 millilitres d’IMDM pour recueillir plus de cellules. Regrouper toutes les collections, les centrifuger, et remettre en suspension la pastille dans 3 millilitres de MCSF. Maintenant, comptez les cellules et ajustez leur concentration à 1 million par millilitre.

Ensuite, plaquez 100 microlitres de suspension cellulaire par puits dans une plaque à fond plat de 96 puits. L’assiette entière doit pouvoir être remplie. Cultivez les cellules pendant environ une heure jusqu’à ce qu’elles soient adhérentes. Ensuite, stimulez-les avec différentes concentrations de LPS ou d’immunoglobuline intraveineuse ou les deux, préparées dans l’IMDM. Effectuez toutes les manipulations en double ou en triple exemplaire et assurez-vous de garder des témoins non traités, puis, incubez les cellules pendant 24 heures et analysez les surnageants.