Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 5:05 min • July 8th, 2025
Les macrophages péritonéaux, résidant dans la cavité péritonéale, engloutissent les agents pathogènes et sécrètent des cytokines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires pour moduler la réponse immunitaire.
Pour étudier l’activation in vivo des macrophages péritonéaux, commencez par retenir la souris pour minimiser ses mouvements. Prenez un mélange de lipopolysaccharides - antigènes dérivés d’agents pathogènes et d’immunoglobulines intraveineuses - et injectez-les par voie intrapéritonéale.
Après l’injection, les lipopolysaccharides se lient aux récepteurs de reconnaissance des modèles des macrophages, déclenchant une réponse immunitaire et libérant des cytokines pro-inflammatoires, y compris l’IL-12.
En revanche, les immunoglobulines interagissent avec les récepteurs Fc des macrophages, régulant à la baisse la réponse immunitaire en supprimant la production d’IL-12 et en favorisant la libération de cytokines anti-inflammatoires, y compris l’IL-10. Cette co-stimulation par les lipopolysaccharides et les immunoglobulines active les macrophages péritonéaux en macrophages anti-inflammatoires.
Fixez la souris euthanasiée et faites une incision longitudinale le long de la cavité abdominale. Rétractez la peau du muscle abdominal. Injecter un tampon dans la cavité péritonéale ; agiter pour déloger les cellules de la cavité péritonéale.
Prélevez le liquide péritonéal activé contenant des macrophages.
Cultivez ces macrophages activés dans un milieu contenant des molécules co-stimulatrices - immunoglobulines et lipopolysaccharides pour permettre la production de cytokines. Prélever le milieu usé et quantifier les niveaux de cytokines à l’aide d’un test immuno-enzymatique.
Une concentration d’IL-10 plus élevée que celle d’IL-12 confirme le succès de l’activation péritonéale des macrophages anti-inflammatoires.
Préparez une seringue de 1 millilitre avec la quantité requise d’immunoglobuline intraveineuse et de LPS, et fixez-y une aiguille de calibre 26. Pour les commandes, utilisez plutôt PBS plus LPS.
Saisissez la souris par sa peau tout en sécurisant son arrière-train et sa queue d’une seule main. Ciblez le quadrant inférieur droit de l’abdomen et insérez l’aiguille à un angle de 30 à 40 degrés avec le biseau vers le haut, puis insérez-la à environ 1,5 cm. Ensuite, injectez le bolus. Au bout d’une heure, récoltez les macrophages péritonéaux après avoir euthanasié la souris.
Dans une cagoule stérile, épinglez la souris euthanasiée à une planche de mousse avec les membres écartés et stérilisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, faites une incision peu profonde de 2 millimètres le long de la ligne médiane et retirez la peau abdominale. Évitez de perforer la paroi péritonéale.
Ensuite, chargez complètement une seringue de 5 millilitres avec du PBS stérile à pH 7,4 et injectez la souris à l’aide d’une aiguille de calibre 25 ou 27 en haut de la cavité péritonéale de chaque côté vers la ligne médiane avec le biseau de l’aiguille vers le haut. Après avoir retiré l’aiguille, massez le péritoine pendant 10 secondes pour déloger les cellules.
Maintenant, réinsérez l’aiguille dans la cavité et recueillez environ 3,75 millilitres de liquide de lavage. Transférez le liquide de lavage dans un tube conique de 15 millilitres sur de la glace. Répétez l’injection, le massage et la collecte du liquide de lavage trois fois de plus, et regroupez toutes les collections dans le même tube.
Lors de la collecte finale, il peut être plus facile de retirer le liquide de lavage de l’autre côté de la souris. Ensuite, faites tourner les cellules et remettez-les en suspension dans 500 microlitres de milieu de placage. Ensuite, comptez les macrophages viables et mettez-les en suspension à 1 million par millilitre. Maintenant, plaquez 100 microlitres de suspension dans les puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Ensuite, incubez les cellules pendant une heure.
Les macrophages péritonéaux vont adhérer à la plaque. Ensuite, retirez les cellules non adhérentes et rincez bien chacune deux fois avec 200 microlitres d’IMDM chaud. Après chaque lavage, attendez 10 secondes et inclinez lentement la plaque pour accumuler la solution de rinçage. Après les lavages, rajoutez 100 microlitres de milieu de placage et placez la plaque dans l’incubateur.
Pour l’ELISA, continuez à incuber les cellules sans stimulation pendant 24 heures. Ensuite, collectez et clarifiez le milieu conditionné pour l’analyse des cytokines.