Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 8:18 min • July 8th, 2025
Pour étudier l’immunité induite par le vaccin, prenez une injection remplie d’un vaccin acellulaire contre la coqueluche. Le vaccin contient des protéines antigéniques d’une bactérie causant une maladie respiratoire – Bordetella pertussis, et des adjuvants qui prolongent l’exposition à l’antigène pour une réponse immunitaire soutenue.
Injectez le vaccin par voie intramusculaire dans une souris anesthésiée.
Après l’injection, les cellules présentatrices d’antigènes résidentes, les APC, capturent et transforment les protéines antigéniques en peptides, les présentant à leur surface. Ces APC migrent ensuite vers les ganglions lymphatiques voisins et interagissent avec les lymphocytes T, initiant leur activation et leur différenciation en lymphocytes T effecteurs.
Ces lymphocytes T effecteurs circulent et migrent vers divers organes, y compris les poumons, où ils résident en tant que lymphocytes T mémoires résidents ou lymphocytes TRM, conduisant à l’immunisation.
Après l’immunisation, administrer par voie intranasale une souche vivante de Bordetella pertussis résistante aux antibiotiques. Ces bactéries pénètrent dans le tissu pulmonaire et activent les lymphocytes TRM. Les cellules TRM activées sécrètent des cytokines inflammatoires qui recrutent les cellules immunitaires pour provoquer la clairance bactérienne.
Récoltez le tissu pulmonaire de la souris et homogénéisez-le pour obtenir une suspension unicellulaire. Étalez la suspension cellulaire diluée sur une plaque de gélose contenant un antibiotique et incubez-la pour permettre la formation de colonies bactériennes.
L’extrait de tissu d’une souris immunisée présente moins de colonies que celui d’une souris non immunisée, ce qui confirme l’immunité induite par le vaccin contre Bordetella pertussis.
Pour l’immunisation, confirmer l’absence de réponse au pincement des orteils chez une souris anesthésiée âgée de 6 à 12 semaines et charger une seringue d’insuline de 1 millilitre munie d’une aiguille de calibre 28,5 avec 0,1 millilitre du vaccin d’intérêt. En tenant la seringue à un angle de 45 degrés avec le biseau vers le haut, insérez l’aiguille à environ 5 millimètres dans le deltoïde de la souris et injectez le vaccin.
Gardez l’aiguille insérée dans le muscle pendant 5 à 10 secondes. Ensuite, faites pivoter la seringue de 180 degrés de manière à ce que le biseau soit orienté vers le bas pour créer un joint et pour éviter les fuites de vaccin avant de rétracter lentement l’aiguille du site d’injection. Ensuite, remettez la souris dans sa cage avec surveillance jusqu’à la récupération complète.
Environ deux semaines après le rappel, infectez les souris immunisées. Saisissez une souris anesthésiée par la peau du thorax dorsal derrière les omoplates et le cou, et positionnez la souris à la verticale pour accéder au nez. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, appliquez lentement 20 à 25 microlitres de l’inoculum bactérien d’intérêt sur chaque couche de l’animal, en tenant la souris jusqu’à ce que tout l’inoculum ait été inhalé. Ensuite, administrez un volume égal de PBS stérile à un groupe de souris en tant que contrôle négatif.
Au point final expérimental approprié, placez une souris infectée face ventrale vers le haut sur une planche de dissection et fixez les membres. Mouillez le corps avec de l’éthanol à 70 % et utilisez des pinces pour serrer la peau sous l’abdomen au centre du bassin. À l’aide de ciseaux bien aiguisés, faites une coupe verticale jusqu’à la mandibule et disséquez la peau de la paroi péritonéale. Déplacez la peau sur les côtés de la carcasse pour créer un champ dégagé pour le prélèvement d’organes stériles, et saisissez le péritoine intact sous la cage thoracique au niveau ou près du foie. Coupez le péritoine vers la cage thoracique pour exposer le tube digestif inférieur et déplacez le côlon vers la gauche pour révéler la rate.
À l’aide d’une pince incurvée, saisissez la rate et disséquez le tissu conjonctif avec des ciseaux. Ensuite, placez la rate dans un tube conique de 15 millilitres contenant 3 millilitres de RPMI et 5 % de sérum fœtal bovin sur de la glace. Utilisez une pince pour stabiliser la cage thoracique au stade xiphoïde et ouvrez le diaphragme. Les poumons doivent se dégonfler et tomber vers la colonne vertébrale.
Ouvrez la cage thoracique sur les côtés pour retirer le plastron, et coupez les artères et les veines pulmonaires pour isoler et retirer le lobe supérieur du poumon droit. Fixez le lobe dans un tube conique de 15 millilitres de formol à 10 % de neutre à température ambiante pendant au moins 24 heures et isolez les lobes restants des poumons droit et gauche. Ensuite, placez les lobes dans un tube conique de 15 millilitres contenant 2 millilitres de caséine à 1 % dans du PBS sur glace.
Utilisez un PIPETMAN de 1 millilitre avec embout pour recueillir le sang remplissant la cavité thoracique et transférez le sang dans un tube de microcentrifugation pré-étiqueté de 1,5 millilitre sur de la glace. Enlever les glandes parotide, sublinguale et sous-maxillaire, ainsi que les ganglions lymphatiques recouvrant la trachée, et ouvrir et retirer les membranes protectrices entourant la trachée. À l’aide de pinces fines et de ciseaux, séparez soigneusement la trachée de l’œsophage et tout autre tissu conjonctif du haut des clavicules jusqu’au bas de la mandibule.
Utilisez une pince pour tenir la trachée et coupez la trachée au sommet de la clavicule. Tirez la trachée vers le bas pour maximiser l’élasticité et coupez la trachée au bas de la mandibule juste au-dessus du larynx, en isolant environ 1 centimètre de tissu. Ensuite, placez l’organe dans un tube de microcentrifugation pré-étiqueté de 1,5 millilitre contenant 0,3 millilitre de caséine à 1 % dans du PBS sur glace.
Maintenant, tournez la souris pour un accès clair au nez et vaporisez la tête avec de l’éthanol à 70 %. Manuellement, saisissez l’animal directement derrière le crâne et utilisez des ciseaux pour couper la chair molle du museau, en commençant par le bas du nez et en remontant vers le haut. Retirez la fourrure, la peau et les moustaches autour du nez et insérez les pointes d’une paire de ciseaux incurvés dans les narines avec les courbes pointées vers le bas.
Coupez le passage nasal vers les yeux, créant une formation en forme de V. Ensuite, utilisez des pinces fines pour recueillir la cloison nasale et les tissus mous de la formation, et placez le tissu dans un tube de microcentrifugation pré-étiqueté de 1,5 millilitre contenant 0,3 millilitre de caséine à 1 % dans du PBS sur glace.
Pour traiter le tissu pulmonaire, transférez tout le contenu du tube d’échantillon pulmonaire dans un homogénéisateur stérile de 15 millilitres et utilisez un pilon pour homogénéiser le tissu. Dissociez l’échantillon jusqu’à ce qu’il ne reste plus de grosses particules de tissu et remettez la suspension homogénéisée dans le tube d’origine de 15 millilitres. Prélever une aliquote de 0,3 millilitre pour le placage des unités formant des colonies et recueillir le reste de l’homogénat par centrifugation.
Aliquote 0,5 millilitre de surnageant dans des tubes de microcentrifugation pré-marqués pour un stockage à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse de l’expression des cytokines par ELISA. Ensuite, diluez en série 0,1 millilitre d’aliquotes de la suspension pulmonaire homogénéisée dans 0,9 millilitre de PBS stérile par dilution, et utilisez un écarteur triangulaire stérile pour plaquer 0,1 millilitre de chaque dilution choisie empiriquement sur des plaques pré-étiquetées de 10 % de Bordet-Gengou plus streptomycine.