Dynamique des organites dans les lymphocytes B après activation avec des billes enrobées d’antigène

Les récepteurs des lymphocytes B, les BCR, sur les lymphocytes B, se lient aux antigènes, provoquant l’activation cellulaire. Cela conduit à l’internalisation de l’antigène pour la transformation en fragments peptidiques, qui sont chargés sur des molécules du CMH de classe II pour être présentés aux lymphocytes T auxiliaires afin de générer une réponse immunitaire efficace.

Pour étudier l’activation des lymphocytes B in vitro à l’aide de billes enrobées d’antigène, il faut d’abord obtenir des billes enrobées d’antigène. Ces billes sont enrobées de manière covalente d’antigènes, des ligands spécifiques des RCO ; une protéine non réactive bloque les sites de billes non liés, empêchant la liaison non spécifique des lymphocytes B.

Ajouter les billes à la suspension de lymphocytes B. Ensemencez le mélange sur une lamelle enrobée de poly-L-lysine.

Les lymphocytes B chargés négativement se lient à la lamelle chargée positivement, immobilisant les cellules. De plus, les antigènes des billes se lient spécifiquement aux BCR. L’interaction du BCR avec l’antigène active les lymphocytes B, formant une jonction serrée – une synapse immunitaire.

L’interaction initie des voies de signalisation intracellulaires, entraînant une réorganisation du cytosquelette d’actine. Cela provoque l’étalement de la membrane cellulaire suivi d’une contraction, au cours de laquelle le microcluster de l’antigène BCR se concentre au centre des synapses immunitaires.

Avec le remodelage de l’actine, le centrosome – un centre d’organisation des microtubules – se repositionne près de la synapse. Le repositionnement recrute des organites comme les lysosomes et l’appareil de Golgi près de la synapse immunitaire pour extraire et présenter les antigènes.

Les billes enrobées d’antigène sont préparées en incubant des ligands spécifiques avec des billes d’aminés préalablement traitées au glutaraldéhyde pour activer les groupes aminés. Remettre en suspension les billes activées dans 100 microlitres de PBS et vortex. Pendant ce temps, préparez la solution antigénique en ajoutant 100 microgrammes par ml de ligand BCR dans 150 microlitres de PBS.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de billes activées à la solution d’antigène et incubez pendant la nuit à 4 degrés Celsius. N’oubliez pas d’utiliser également un ligand non apparenté comme contrôle négatif. Après l’incubation, laver le cordon avec du PBS, aspirer le surnageant et le remplacer par du PBS. Répétez l’opération trois fois. Ensuite, bloquez les groupes aminés libres en remettant en suspension des billes dans 500 microlitres d’une solution de BSA. Enfin, remettre en suspension les billes dans 70 microlitres de PBS.

Pour calculer la concentration finale, vous pouvez utiliser un hémocytomètre pour compter les billes. Pour l’activation des lymphocytes B, utilisez un tube de 50 ml et mettez les cellules en suspension à une concentration de 1,5 million par ml dans du CLICK complété par 5 % de sérum fœtal bovin. Ensuite, ajoutez 150 000 cellules B correspondant à 100 microlitres du mélange cellule-bille dans une lamelle recouverte de poly-L-lysine, et incubez à 37 degrés pour les différents points temporels.