Effet de l’anticorps anti C-fms sur l’ostéoclastogenèse dans les cellules de moelle osseuse de souris in vitro

L’ostéoclastogenèse est le processus par lequel les précurseurs des ostéoclastes se différencient et fusionnent pour former des ostéoclastes multinucléés.

Pour étudier l’effet de l’anticorps anti-c-fms sur l’ostéoclastogenèse in vitro, prenez une plaque de culture contenant une suspension de cellules de moelle osseuse de souris. Ajouter le facteur de stimulation des colonies de macrophages, le M-CSF.

En culture, le M-CSF se lie à son récepteur spécifique, le c-fms, sur les cellules précurseurs myéloïdes, activant les voies de signalisation et provoquant la différenciation en macrophages de la moelle osseuse, les BMM, qui représentent les précurseurs des ostéoclastes et adhèrent à la plaque.

Retirez les cellules non adhérentes. Récoltez les BMM et semez-les dans des puits à plaques multi-puits. Supplément de M-CSF et d’activateur du récepteur du ligand du facteur nucléaire kappa-B, RANKL.

Ajoutez des concentrations croissantes d’anticorps anti-c-fms dans les puits.

Dans le puits témoin, le M-CSF se lie aux récepteurs c-fms et active les voies de signalisation, stimulant l’expression du récepteur RANK et favorisant la survie et la prolifération des BMM. RANKL se lie aux récepteurs RANK, déclenchant une cascade de signalisation et provoquant la différenciation et la fusion des BMM en ostéoclastes.

Dans les puits où les concentrations d’anticorps sont plus élevées, les anticorps se lient et bloquent efficacement les récepteurs c-fms et perturbent la signalisation nécessaire à la différenciation des ostéoclastes, inhibant ainsi la formation d’ostéoclastes.

Effectuer une coloration pour identifier et quantifier les populations d’ostéoclastes et déterminer la concentration efficace d’anticorps pour inhiber l’ostéoclastogenèse dans la formation d’ostéoclastes induite par RANKL.

Ensemencez 10 millions de cellules par 10 millilitres dans une boîte de culture de 10 centimètres et ajoutez du M-CSF aux cellules. Incuber la culture à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 3 jours. Retirez le milieu après trois jours et lavez les cellules deux fois, vigoureusement, avec 10 millilitres de PBS pour éliminer les cellules non adhérentes.

Ajoutez 5 millilitres de trypsine-EDTA à température ambiante 0,02 % dans du PBS et incubez à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 5 minutes. Pipetez soigneusement les cellules pour les détacher. Observez la culture au microscope pour vous assurer que les cellules ont été détachées et qu’elles apparaissent arrondies et flottantes dans le milieu.

Lorsque les cellules ont été détachées, inactivez la réaction en ajoutant 5 millilitres d’alpha-MEM. Rassemblez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres et centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes. Après avoir jeté le surnageant, laver avec 5 millilitres d’alpha-MEM et centrifuger à nouveau à 300 x g pendant 5 minutes. Remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres d’alpha-MEM.

Semez 1 million de cellules par 10 millilitres dans une boîte de culture de 10 centimètres et ajoutez du M-CSF. Incuber la culture à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 3 jours. Récoltez les cellules attachées, qui représentent les BMM comme des précurseurs d’ostéoclastes après 3 jours. Semez des BMM à 50 000 cellules par 200 microlitres d’alpha-MEM dans une plaque de 96 puits, par puits.

À chaque puits, ajoutez les stimuli souhaités, puis ajoutez du M-CSF pour une concentration finale de 100 nanogrammes par millilitre. Ajoutez de l’anticorps anti-c-fms dans chaque puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 4 jours, tout en changeant de milieu tous les deux jours pendant 4 jours, puis procédez à la coloration et aux dosages comme décrit dans le manuscrit.