Un système de culture d’organes intestinaux ex vivo pour étudier les interactions hôte-microbiote

Pour étudier les interactions entre l’hôte et le microbiote intestinal ex vivo, commencez par un tissu murin du côlon exempt de bactéries spécifiques colonisant l’intestin. Rincer le tissu avec un milieu pour enlever les matières fécales et transférer dans une plaque multipuits contenant un milieu approprié.

En même temps, assemblez le dispositif de culture d’organes intestinaux ex vivo à plusieurs puits.

Chaque puits de l’appareil comprend deux ports d’entrée et de sortie appariés - le premier se connectant à la lumière du côlon et le second fournissant une alimentation continue de fluide aux puits pour maintenir la viabilité des tissus.

Transférez le tissu dans l’appareil. Connectez les extrémités proximale et distale du côlon à la première paire de ports d’entrée et de sortie. Démarrez le flux de stimulants luminaux dans la lumière du côlon et le flux moyen dans le puits.

Le stimulant contient des bactéries colonisatrices de l’intestin qui sécrètent des enzymes dégradant la couche de mucus, leur permettant de se fixer aux cellules épithéliales sous-jacentes. Cela active une cascade de signalisation qui déclenche les cellules dendritiques résidentes pour étendre leurs dendrites entre les cellules épithéliales, capturant les antigènes bactériens et générant des réponses immunitaires spécifiques.

Par conséquent, les lymphocytes T CD4+ naïfs se différencient en lymphocytes Th17.

Les cellules Th17 produisent des cytokines pro-inflammatoires qui activent d’autres cellules immunitaires pour combattre les agents pathogènes envahissants et maintenir l’intégrité de la barrière intestinale.

Pour commencer, insérez les aiguilles à extrémité émoussée à la position appropriée dans le moule de l’appareil et coulez environ 20 g de mélange de polydiméthylsiloxane ou de PDMS pour un ensemble de l’appareil et du couvercle. Placez les moules dans une chambre à vide pendant 30 minutes pour éliminer les bulles d’air du mélange PDMS, puis incubez les moules à 55 degrés Celsius pendant la nuit pour terminer la polymérisation PDMS.

Lorsque le PDMS est réglé, retirez les aiguilles du moule et libérez soigneusement le dispositif de culture et le couvercle des moules en plastique. Éliminez les résidus de PDMS du contour du puits à l’aide d’une lame chirurgicale.

Fixez le dispositif PDMS dans le couvercle de l’appareil sur un verre de protection de microlames de 75 x 50 millimètres à l’aide d’un adhésif silicone non toxique et laissez les pièces prendre toute la nuit. Appliquez la colle sur le côté lisse de l’appareil. Insérez 12 aiguilles de calibre 22 pour la lumière et 12 aiguilles de calibre 18 pour le puits. Fixez toutes les aiguilles en place à l’aide de silicone et laissez-les prendre toute la nuit.

Purgez les seringues d’entrée et assurez-vous que le fluide puits s’écoule de tous les tubes dans un verre usagé. Ensuite, purgez les seringues d’entrée, et assurez-vous que les stimulations s’écoulent de tous les tubes dans un verre usagé, en prenant soin de ne pas contaminer les différentes stimulations.

Après avoir sacrifié la souris, utilisez des ciseaux tranchants et des pinces pour la disséquer, et retirez le tube digestif de l’estomac à l’anus en coupant toute la graisse et les tissus conjonctifs. Coupez le côlon et placez-le sur une nouvelle assiette. Minimisez le contact tout en tenant le tissu doucement et uniquement sur les bords. Effectuez le rinçage du côlon sous le microscope de dissection.

Rincez doucement le contenu du côlon avec de l’IMDM stérile avec la seringue de 10 millilitres préparée comme décrit dans le texte. Après avoir retiré les matières fécales du tissu intestinal, placez le côlon dans une nouvelle plaque à 6 puits remplie de 0,5 millilitre d’IMDM stérile. Ensuite, prenez le tissu du côlon et connectez-le soigneusement à l’aiguille de calibre 22, en faisant une attache serrée avec les deux fils.

Maintenez l’orientation correcte du côlon par rapport au flux de lumière de sorte que le proximal et le distal soient respectivement égaux à l’entrée et à la sortie. Répétez le rinçage du côlon et l’attache à l’aiguille pour tous les tissus. Connectez les tubes d’entrée et de sortie à l’appareil, puis commencez l’expérience en démarrant les pompes aux vitesses souhaitées.