Synthèse in vitro de biofilm par Staphylococcus aureus

Les biofilms bactériens sont des structures tridimensionnelles composées de communautés bactériennes intégrées dans une matrice extracellulaire auto-générée, qui échappent à la réponse immunitaire de l’hôte.

Pour la préparation in vitro d’un biofilm de Staphylococcus aureus, transférez une suspension de Staphylococcus aureus en croissance active de la densité cellulaire souhaitée dans les puits recouverts de poly-L-lysine d’une plaque multi-puits.

Pendant l’incubation dans des conditions statiques, le revêtement en poly-L-lysine chargé positivement facilite les interactions électrostatiques avec les glycopolymères chargés négativement, tels que les acides teichoïques, à la surface bactérienne, favorisant ainsi la fixation bactérienne.

Avec les sources de nutriments disponibles, Staphylococcus aureus se divise et s’accumule, formant des microcolonies. De plus, les bactéries sécrètent une matrice extracellulaire comprenant des polysaccharides, des protéines et de l’ADN extracellulaire, qui enveloppe les cellules et favorise la cohésion bactérienne et l’adhésion de surface.

Avec la division cellulaire continue et la sécrétion matricielle, le biofilm se transforme en une structure tridimensionnelle avec une distribution efficace des molécules de signalisation pour la communication de cellule à cellule.

Lorsqu’il atteint un seuil de densité bactérienne, Staphylococcus aureus sécrète des protéases et des nucléases, dégradant la matrice du biofilm et libérant quelques staphylocoques dorés dans le milieu. Retirez le milieu contenant des bactéries planctoniques flottantes.

Ajoutez doucement un tampon pour éviter la rupture du biofilm. Retirez le tampon contenant les bactéries non attachées restantes.

Le biofilm généré est prêt pour les expériences en aval.

Commencez par obtenir des colonies isolées de Staphylococcus aureus à partir d’un stock cryoconservé en utilisant une technique de plaque striée sur une plaque de gélose riche en nutriments telle que la gélose tryptique de soja. Enduire les puits individuels d’une plaque de 96 puits avec 100 microlitres de PLL dilués dans de l’eau stérile et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Aspirer la solution PLL de manière aseptique, à l’aide d’un piège d’aspiration assisté par le vide. Laissez les puits sécher toute la nuit à température ambiante.

Préparez une culture de nuit en inoculant une colonie de S. aureus dans MEM-alpha complétée par 2 % de glucose, et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures à 200 rotations par minute. Diluez la culture de nuit en transférant 50 microlitres à 5 millilitres de MEM-alpha frais complété par 2 % de glucose. Ensuite, incubez-le à 37 degrés Celsius à 200 rotations par minute jusqu’à ce que la phase logarithmique moyenne soit atteinte. Utilisez MEM-alpha pour normaliser la culture logarithmique moyenne à une DO de 0,1.

Transférez 150 microlitres de culture normalisée dans chaque puits de la plaque de 96 puits traitée par PLL. Incuber la plaque dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 18 à 20 heures. Aspirer le surnageant pour éliminer les cellules planctoniques. Lavez doucement la biomasse restante avec 150 microlitres de HBSS pour éliminer les cellules détachées. Répétez au moins deux fois l’opération pour éliminer toutes les cellules planctoniques.