Une technique in vitro pour stimuler les lymphocytes via des bactéries pathogènes

Pour stimuler les lymphocytes via Haemophilus influenzae - une bactérie pathogène, prenez une suspension de cellules mononucléées isolées du sang périphérique, ou PBMC, y compris les lymphocytes et les cellules présentatrices d’antigènes ou APC.

Ajouter une suspension bactérienne et incuber à température physiologique.

Les récepteurs de reconnaissance de formes sur les APC se lient à des composants spécifiques des cellules bactériennes, déclenchant la phagocytose. Le phagosome – contenant des bactéries internalisées – fusionne avec le lysosome, provoquant la dégradation bactérienne et la transformation en fragments peptidiques.

Les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité ou CMH se lient aux fragments peptidiques et les présentent à la surface cellulaire sous forme d’antigènes. Les lymphocytes T se lient à l’antigène présenté via le récepteur des lymphocytes T.

Ajoutez des anticorps co-stimulateurs qui se lient à des récepteurs de surface spécifiques sur les lymphocytes T. La liaison synergique induit une signalisation en aval, activant la production de cytokines des lymphocytes T.

Ajoutez un composé bloquant Golgi – bloquant le transport des protéines vésiculaires du réticulum endoplasmique au Golgi – pour inhiber la sécrétion de cytokines par les lymphocytes T, facilitant ainsi l’accumulation de cytokines intracellulaires.

Ajouter un fixateur pour préserver la morphologie cellulaire et un détergent pour perméabiliser la membrane cellulaire. Ajoutez un cocktail d’anticorps marqués par fluorescence, y compris des anticorps se liant aux marqueurs de surface spécifiques des lymphocytes T – marquant la surface cellulaire – et des anticorps spécifiques aux cytokines qui pénètrent à l’intérieur de la cellule pour se lier aux cytokines intracellulaires.

Effectuez une cytométrie en flux pour détecter les cellules à double fluorescence, indiquant la production de cytokines par les lymphocytes T stimulés.

Divisez l’échantillon de sang périphérique en aliquotes pour le contrôle et la stimulation de l’antigène. Ajoutez des anticorps co-stimulateurs aux deux échantillons, puis ajoutez le H. influenzae non typable à l’échantillon d’antigène, et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 1 heure.

Ensuite, ajoutez l’agent bloquant Golgi Brefeldin A aux échantillons et incubez-les pendant cinq heures supplémentaires. Après avoir lysé les érythrocytes comme démontré précédemment, fixez les leucocytes à l’aide de 500 microlitres de paraformaldéhyde à 1 % à 2 % pendant 1 heure. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, puis perméabilisez 1 million de cellules avec 100 microlitres de saponine à 0,1 % pendant 15 minutes.

Ensuite, incubez les cellules avec des anticorps fluorescents appropriés. Lavez les cellules, puis analysez-les à l’aide d’un cytomètre en flux. Déterminez la proportion de cellules répondantes à l’antigène en tenant compte des populations de lymphocytes concernées. Effectuer une coloration de fond sur des cellules non stimulées pour l’ensemble des cytokines à analyser.