Quantification des médiateurs inflammatoires dans des cellules dérivées de tissus humains infectés

Au cours d’une infection, les lymphocytes activés libèrent des médiateurs inflammatoires – les cytokines – pour provoquer une réponse immunitaire.

Pour quantifier les médiateurs inflammatoires dans un tissu infecté, il faut commencer par une suspension cellulaire contenant des cellules immunitaires dérivées de tissus pulmonaires humains.

Incuber les cellules avec Haemophilus influenzae, une bactérie pathogène respiratoire. Les antigènes de surface de la bactérie interagissent avec les récepteurs de reconnaissance de formes sur les cellules immunitaires phagocytaires. Cela déclenche l’internalisation de la bactérie, la transformation en peptides plus petits et la présentation du peptide par la molécule du complexe majeur d’histocompatibilité.

La molécule antigène-CMH-II sur les cellules phagocytaires se lie aux lymphocytes T par le biais des récepteurs des lymphocytes T, ainsi que des interactions co-stimulatrices entre les récepteurs, entraînant l’activation des lymphocytes T et la production de cytokines pro-inflammatoires.

Traitez les cellules avec des bloqueurs de Golgi, ce qui altère la libération de cytokines, provoquant leur accumulation à l’intérieur des cellules. Lavez les cellules avec un tampon de blocage pour bloquer les sites de liaison non spécifiques.

Colorez la suspension cellulaire avec un mélange d’anticorps marqués au fluorophore qui se lient spécifiquement aux marqueurs de surface des lymphocytes T humains, permettant ainsi le marquage des lymphocytes.

Fixez les cellules et perméabilisez-les avec un tensioactif formant des pores. Incuber les cellules perméabilisées avec des anticorps anti-cytokines marqués au fluorophore, qui pénètrent dans les cellules et interagissent avec des cytokines spécifiques.

À l’aide de la cytométrie en flux, mesurez le signal de fluorescence des cytokines dans les lymphocytes marqués, en corrélation avec la production de médiateurs inflammatoires due à une infection bactérienne.

Coupez environ 20 à 40 grammes de l’échantillon de lobectomie en sections de 3 à 5 millimètres cubes. Placez-les dans une chambre stérile de 50 microlitres et fragmentez mécaniquement le tissu à l’aide d’un désagrégateur approprié. Après la désagrégation tissulaire, lyser les globules rouges comme démontré et remettre les cellules en suspension dans un RPMI stérile. Ensuite, filtrez les cellules à travers un maillage en nylon stérile de 100 micromètres et comptez le nombre de cellules viables à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu de trypan.

Pour le test d’infection, remettre en suspension les cellules pulmonaires dans l’IPRP jusqu’à une concentration finale de 4 millions de cellules par millilitre par tube. Ensuite, infectez les cellules à un moment d’inertie de 100 bactéries par cellule. Desserrez le capuchon d’une demi-rotation pour permettre le transfert de gaz dans les tubes. Placez les cellules dans le rotateur de tube et incubez-les à 37 degrés Celsius, tout en tournant à 12 tr/min. Une heure après la stimulation, ajoutez Brefeldin A pour empêcher l’exportation extracellulaire de cytokines, et incubez les suspensions cellulaires pendant 16 à 22 heures supplémentaires avec rotation.

Le lendemain, lavez la suspension cellulaire avec 500 microlitres de PBS contenant 1 % d’albumine sérique bovine et 0,01 % d’azoture de sodium. Ensuite, restez dans la suspension cellulaire pour des marqueurs de surface cellulaires lymphocytaires humains spécifiques pendant une heure. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS et fixez-les et perméabilisez-les, comme démontré précédemment. Ensuite, incubez les cellules avec des anticorps intracellulaires de coloration des cytokines pendant une heure. Ensuite, laver les cellules et les remettre en suspension dans 100 microlitres de PBS, avant l’acquisition des données sur un cytomètre en flux.