Détermination de la production de ROS par les neutrophiles lors de l’interaction avec un biofilm opsonisé

Les bactéries marquées avec des opsonines sont reconnues par des récepteurs neutrophiles spécifiques, déclenchant la phagocytose avec des espèces réactives de l’oxygène, ou ROS, et la dégradation bactérienne.

Pour quantifier la production de ROS par les neutrophiles in vitro, on prend une plaque multi-puits. Le puits d’essai contient un biofilm de Staphylococcus aureus composé de bactéries intégrées dans un film de matrice extracellulaire. Le puits de contrôle est sans le biofilm.

Incuber le biofilm avec du sérum humain, permettant aux opsonines sériques d’opsoniser le biofilm.

Aspirez le sérum. Laver avec un tampon, en éliminant les opsonines non liées. Ajoutez des neutrophiles et du luminol – un composé chimiluminescent – dans les puits. Centrifugeuse, en amenant les neutrophiles près du biofilm.

À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez la luminescence au fil du temps.

Dans le puits contenant le biofilm, les neutrophiles se lient aux opsonines du biofilm, provoquant l’activation des neutrophiles et l’internalisation bactérienne dans les phagosomes. Des voies de signalisation spécifiques sont activées, provoquant l’assemblage de la NADPH oxydase sur les phagosomes.

La NADPH oxydase catalyse le transfert d’électrons du NADPH à l’oxygène moléculaire, générant des ROS qui dégradent les bactéries. De plus, la NADPH oxydase sur la membrane cellulaire libère des ROS de manière extracellulaire.

En réponse, les bactéries du biofilm produisent des enzymes qui neutralisent les ROS et libèrent des leucocidines qui forment des pores dans les membranes des neutrophiles et provoquent la lyse, perturbant ainsi la production de ROS. Le luminol réagit avec les ROS, provoquant son excitation, et émet une luminescence lors de la relaxation.

Le puits d’essai présente des niveaux de ROS accrus par rapport au témoin, indiquant des interactions entre les biofilms opsonisés par les neutrophiles.

Ajoutez 100 microlitres de sérum humain normal à 20 % dilué dans du HBSS, goutte à goutte, dans le biofilm lavé, et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour opsoniser le biofilm. Aspirez la solution sérique et lavez les biofilms, goutte à goutte, avec 150 microlitres de HBSS. Aspirer le HBSS, laissant derrière lui des puits avec des biofilms opsonisés.

Ajouter du luminol aux neutrophiles remis en suspension dans HBSS pour obtenir une concentration finale de 5 micromolaires de luminol. Cette solution est prête à l’emploi pour les groupes A et C. Ajouter des neutrophiles mélangés à du luminol dans les puits avec des biofilms opsonisés.

Pour le groupe D, préparez une solution de luminol de 50 micromolaires dans du HBSS dans un tube séparé sans aucun neutrophile, et ajoutez-la dans le puits contenant le biofilm. Aliquote 350 microlitres de neutrophiles mélangés à du luminol, et ajouter du PMA à une concentration finale de 500 nanogrammes par millilitre au mélange.

Pour le groupe B, ajoutez les neutrophiles de ce mélange dans des puits sans biofilm. Il s’agit d’un contrôle positif. Centrifugez la plaque à 270 RCF pendant 30 secondes à 4 degrés Celsius. Assurez-vous que le lecteur de plaques est réglé à 37 degrés Celsius, que la luminescence et la cinétique sont indiquées pendant 60 minutes avec des intervalles de 3 minutes.

Placez la plaque dans le lecteur de plaques pour mesurer la production de ROS par les neutrophiles pendant 60 minutes.