Un essai in vitro pour étudier l’interaction entre les neutrophiles et le biofilm

Un biofilm est une communauté de bactéries adhérant en surface intégrées dans une matrice de substances polymères extracellulaires, EPS, d’origine microbienne.

Pour étudier in vitro les interactions entre les cellules immunitaires et le biofilm, prenez une lame avec un canal contenant un biofilm de Staphylococcus aureus – un agent pathogène opportuniste. Les bactéries modifiées expriment une protéine fluorescente pour la détection microscopique. Le canal se connecte à des réservoirs remplis de milieux pour fournir des nutriments aux bactéries.

Ajouter une suspension de neutrophiles marqués avec un colorant fluorescent de suivi des cellules. Le milieu contient également un homodimère d’éthidium, qui colore l’ADN des cellules mortes. Incuber dans des conditions physiologiques.

Les récepteurs de reconnaissance de formes sur les neutrophiles se lient aux motifs moléculaires associés aux agents pathogènes sur les bactéries. La liaison induit les neutrophiles à phagocyter les bactéries et à produire des espèces de l’oxygène réactives extracellulaires ou ROS, tuant ainsi les bactéries.

Pour échapper à la réponse immunitaire, les bactéries libèrent des enzymes détoxifiantes qui diminuent les ROS et la toxine leucocidine qui provoque la mort cellulaire. La leucocidine monomère se lie à des récepteurs spécifiques sur les neutrophiles et subit une multimérisation pour former un pore, perturbant l’intégrité de la membrane et tuant les cellules.

L’homodimère d’éthidium pénètre à travers la membrane cellulaire endommagée, colorant les cellules mortes.

Sous un microscope à fluorescence à grand champ, un sous-ensemble de cellules bactériennes et de neutrophiles semblent morts, indiquant une interaction neutrophile-biofilm.

Utilisez une souche fluorescente de S. aureus, telle que USA300 exprimant la GFP, pour faciliter l’imagerie par microscopie. Incuber des neutrophiles avec un BCD de 100 micromolaires pendant 30 minutes dans un rocker à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone atmosphérique. Assurez-vous que les échantillons sont incubés dans l’obscurité et limitez l’exposition à la lumière.

Pour laver l’excès de BCD, centrifugez les neutrophiles à 270 RCF pendant cinq minutes et aspirez le surnageant. Remettre les neutrophiles en suspension dans des HBSS frais. Ensuite, ajoutez de l’homodimère d’éthidium-1 aux neutrophiles colorés au BCD à une concentration finale de 4 micromolaires pour surveiller la mort des neutrophiles et des bactéries.

Lavez le biofilm avec du HBSS et ajoutez 150 microlitres de neutrophiles au biofilm de S. aureus qui a été cultivé en microlames. Incuber les microlames dans une chambre humidifiée pendant 30 minutes. Le nombre de cellules bactériennes sera basé sur le nombre de cellules obtenu à partir du placage de biofilm de 18 heures.

Imagez l’interaction du biofilm neutrophile à l’aide de canaux fluorescents correspondant aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission des colorants fluorescents ou des protéines.