Une technique in vitro pour étudier les traitements antimicrobiens sur des agrégats bactériens

Pour étudier l’impact des antimicrobiens sur les agrégats bactériens, prenez une culture de Pseudomonas aeruginosa dans un milieu de croissance qui favorise la formation d’agrégats, simulant la croissance pendant l’infection.

Les bactéries modifiées expriment une protéine fluorescente pour la détection globale au microscope à fluorescence. Image en trois dimensions pour calculer le volume des agrégats, ou la biomasse bactérienne, et visualiser l’augmentation de la biomasse au fil du temps, indiquant la croissance bactérienne.

Ajoutez de la colistine – un peptide cationique antimicrobien – à une concentration sublétale qui tue les bactéries sensibles tout en sélectionnant celles qui résistent aux antibiotiques.

La colistine se lie aux lipopolysaccharides chargés négativement, ou LPS, sur la membrane externe bactérienne, déplaçant les ponts cationiques qui stabilisent la monocouche LPS, endommageant ainsi l’intégrité de la membrane.

La colistine pénètre dans le périplasme et se lie au LPS sur la membrane cellulaire, perturbant la membrane et entraînant une lyse cellulaire. En tant que contre-mécanisme, des mutations génétiques spécifiques dans un sous-ensemble de bactéries neutralisent la charge négative du LPS. Cette modification inhibe l’interaction électrostatique de la colistine cationique avec moins de LPS anionique, empêchant ainsi la mort cellulaire.

Image pour visualiser la diminution de la biomasse avec le temps, indiquant l’impact de l’antimicrobien. Ajoutez de l’iodure de propidium ou PI – un colorant fluorescent – qui pénètre à travers la membrane endommagée pour lier l’ADN, en ne marquant que les cellules mortes.

Effectuez un tri cellulaire activé par fluorescence, ou FACS, en séparant les cellules sensibles marquées PI et les cellules tolérantes aux antibiotiques marquées par fluorescence. Les cellules sont prêtes pour les tests en aval.

Pour imager les agrégats de Pseudomonas aeruginosa à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser, à la fin de l’incubation, il faut désigner trois puits de la plaque de culture comme réplications de traitement antibiotique dans un seul puits « témoin sans traitement », et placer la plaque sur la platine chauffée du microscope.

Sélectionnez un objectif d’immersion dans l’huile 63 fois et ouvrez l’onglet Localiser pour identifier les agrégats bactériens en fond clair. Définissez une zone pour l’imagerie dans chaque puits et utilisez le module Positions pour stocker la position de la zone. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 488 nanomètres et la longueur d’onde d’émission à 509 nanomètres.

Dans le module d’acquisition, sélectionnez l’option Z-Stack pour acquérir les images, et utilisez le module Line Averaging pour réduire la fluorescence de fond dans le canal GFP dans le volume total des images Z-stack. Réglez l’option Série chronologique pour capturer 60 tranches dans chaque puits à des intervalles de 15 minutes pendant 18 heures, et utilisez la stratégie de mise au point définie pour stocker un plan focal pour chaque position qui sera re-imagé à chaque point temporel tout au long de l’expérience.

4,5 heures après la mise en place de l’expérience d’imagerie, imagez chaque position pour déterminer la biomasse agrégée dans chacun des quatre puits avant l’ajout de l’antibiotique. Après six heures, ajoutez doucement l’antibiotique à deux fois en dessous de la concentration minimale inhibitrice au milieu de chaque puits, juste en dessous de l’interface air-liquide, et cliquez sur Démarrer l’expérience pour commencer l’imagerie post-traitement antibiotique.

Pour isoler les cellules vivantes, à la fin de la période d’imagerie de 18 heures, étiquetez les bactéries dans chaque puits avec le volume approprié d’iodure de propidium, selon les recommandations du fabricant. À la fin de l’incubation, utilisez un récipient isolé pour transférer la plaque sur le cytomètre en flux, et réglez le cytomètre pour détecter la GFP et l’iodure de propidium à l’aide d’une buse de 70 microns. Ensuite, analysez des aliquotes de 1 millilitre de chaque surnageant de culture au débit le plus bas pour trier les agrégats viables de Pseudomonas aeruginosa positifs à la GFP et non viables à l’iodure de propidium.