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Immunologie
0 vues • 4:21 min • July 8th, 2025
Prenez une plaque multi-puits contenant une culture de macrophages. Infecter avec Listeria monocytogenes, Lm.
Les protéines de Lm se lient à des récepteurs macrophages spécifiques, internalisant les bactéries dans un phagosome. De plus, Lm sécrète des toxines formant des pores qui perturbent la membrane du phagosome, libérant des bactéries dans le cytosol, où elles se répliquent et sont entourées de filaments d’actine de l’hôte.
Les protéines ActA, induisant l’assemblage de l’actine sur Lm, induisent une polymérisation continue de l’actine à l’extrémité arrière de la bactérie. La queue de comète d’actine générée propulse Lm à travers le cytosol et pénètre dans la membrane cellulaire des macrophages, libérant du Lm polymérisé enveloppé d’actine dans le milieu.
Après l’incubation, recueillir et fixer le milieu extracellulaire, lié à l’actine et contenant du Lm à partir d’un ensemble de puits. Fixez le Lm à l’aide de paraformaldéhyde. Ajouter de l’eau distillée, rompre les macrophages et libérer le Lm intracellulaire. Prélever le Lm intracellulaire et fixer l’échantillon à l’aide de paraformaldéhyde.
Dans d’autres puits, remplacer le milieu par un milieu contenant de la gentamicine imperméable aux cellules pour éliminer le Lm extracellulaire. Remplacer par un milieu frais et incuber pendant la période souhaitée.
Après l’incubation, prélever le milieu extracellulaire contenant du Lm et fixer l’échantillon avec du paraformaldéhyde. Utilisez de l’eau distillée pour obtenir du lysat contenant du Lm intracellulaire et fixez l’échantillon avec du paraformaldéhyde. Ajoutez de la phalloïdine marquée par fluorescence aux échantillons, qui se lie sélectivement à l’actine polymérisée.
À l’aide d’un cytomètre en flux, visualisez les signaux fluorescents de Lm et de la phalloïdine liant l’actine dans les échantillons. Quantifier le Lm lié à l’actine extracellulaire et intracellulaire dérivé des macrophages infectés.
À l’aide d’un compteur de cellules automatisé, ajustez les cellules RAW 264.7 préparées à la concentration de 1 x 106 cellules par millilitre. Ajouter 1 millilitre de l’échantillon dans les puits d’une plaque de culture tissulaire à 6 puits. Infecter les cellules avec l’inoculum Lm préparé correspondant à une multiplicité d’infection de 50.
1,5 heure après l’infection, dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millimètre rempli de 500 microlitres de PFA à 4 %, prélevez le milieu du premier ensemble de puits et placez le tube sur de la glace. Pour recueillir le Lm intracellulaire, ajoutez 1 millilitre d’eau stérile distillée dans chaque puits. Après 60 secondes, transférez le lysat d’eau obtenu dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec 500 microlitres de PFA à 4 %. Agitez vigoureusement le tube pendant 10 secondes et placez-le sur de la glace.
Pour les puits restants, retirez le milieu et remplacez-le par 1 millilitre de DMEM/FCS avec 5 microgrammes par millilitre de gentamicine pour tuer le Lm extracellulaire. Remettez rapidement la parabole dans l’incubateur.
Après 30 minutes, retirez le support et remplacez-le par du DMEM/FCS sans gentamicine. Après deux et quatre heures supplémentaires, collectez le milieu dans des lysats pour la deuxième et la troisième fois dans les tubes et placez-les sur la glace pour les refroidir. Tubes à centrifuger à 10 000 fois g pendant 7 minutes.
À l’aide d’une pipette, prélever le surnageant sans déranger la pastille. Ajoutez un cocktail de coloration contenant 50 microlitres de PFA à 4 % et 15 microlitres de phalloïdine dans le tube, et mélangez pour remettre chaque pastille en suspension. Incuber les tubes dans l’obscurité à 4 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Après l’incubation, ajoutez 1 millilitre de tampon FACS dans chaque tube et pipetez de haut en bas pour mélanger. Faites tourner les tubes dans la centrifugeuse à 10 000 fois g pendant 7 minutes. Retirer le surnageant sans déranger la pastille.
Pour une utilisation immédiate, suspendre chaque granulé dans 400 microlitres de tampon FACS. Si vous le stockez pour une analyse ultérieure, ajoutez 200 microlitres de tampon FACS et 200 microlitres de PFA à 4 % dans le tube et mélangez pour suspendre.