Détection de l’activation de l’inflammasome par microscopie à fluorescence

Pour détecter l’activation de l’inflammasome par le récepteur P3 de type NOD, ou NLRP3, prenez une plaque multipuits contenant des macrophages activés exprimant les protéines NLRP3.

Traitez les cellules avec des milieux contenant des ionophores et de la glycine. Les ionophores induisent l’efflux d’ions potassique, activant et oligomérisant les protéines NLRP3. La NLRP3 oligomérisée recrute des protéines adaptatrices, facilitant la liaison de la pro-caspase-1, formant le complexe inflammasome NLRP3.

Sur l’inflammasome, la proximité déclenche l’auto-clivage de la pro-caspase-1, libérant des caspases actives, initiant la pyroptose et la condensation nucléaire. De plus, la glycine stabilise la structure cellulaire, empêchant la lyse cellulaire.

Traitez les macrophages avec des sondes rapporteures fluorescentes contenant un groupe de liaison caspase-1 et un fluorophore lié par une séquence d’acides aminés. La caspase-1 activée reconnaît la séquence d’acides aminés de la sonde et se lie à son groupe de liaison à la caspase, ce qui permet sa visualisation.

Fixez les cellules et recouvrez-les d’un colorant fluorescent pour colorer les noyaux. Image sous microscope à fluorescence.

Compter les macrophages avec des noyaux condensés bleus et des foyers fluorescents verts de caspase-1 activé, suggérant l’activation de l’inflammasome NLRP3.

Commencez par remplacer le milieu de macrophages dérivés de la moelle osseuse amorcés par le LPS ensemencés sur des lamelles en verre par 290 microlitres de milieu DMEM-5 complété par de la nigéricine à 5 micromolaires et de la glycine à 5 millimolaires par puits. Remettez la plaque de 24 puits dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, en ajoutant 10 microlitres de 30X FAM-YVAD-FMK après les 15 premières minutes.

À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec 1 millilitre de PBS froid par puits trois fois pendant 5 minutes par lavage, et fixez les cellules avec 250 microlitres de paraformaldéhyde à 2 % par puits pendant 30 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière, en étiquetant les cellules avec un colorant nucléaire fluorescent approprié pendant les cinq dernières minutes.

À la fin de l’incubation, laver les cellules trois fois avec du PBS froid comme cela vient d’être démontré, et charger chaque lame avec 7 microlitres de milieu de montage anti-décoloration. Placez une lamelle sur chaque lame et laissez le support de montage durcir pendant la nuit avant de sceller les lamelles avec du vernis à ongles.

Pour imager les cellules par microscopie confocale à fluorescence, placez la lame de contrôle non traitée sur la platine du microscope et faites la mise au point manuellement sur les cellules. À l’aide des paramètres de la table de recherche du microscope, ajustez le décalage jusqu’à ce qu’aucune sonde positive ne soit observée dans les cellules non traitées.

Ensuite, à l’aide d’un échantillon traité à la nigéricine, localisez un champ contenant des cellules à la fois positives et négatives pour la coloration de la sonde, et ajustez le plan d’imagerie du canal de la sonde sur le plan qui présente la plus grande intensité de coloration positive. Ensuite, ajustez le gain jusqu’à ce que les foyers soient visibles dans les cellules avec des noyaux condensés, et obtenez des images de cinq champs sélectionnés au hasard par lame avec un grossissement total de 100X.