Détection de l’activation de l’inflammasome par microscopie à fluorescence

Pour détecter l’activation de l’inflammasome par le récepteur P3 de type NOD, ou NLRP3, prenez une plaque multipuits contenant des macrophages activés exprimant les protéines NLRP3.

Traitez les cellules avec des milieux contenant des ionophores et de la glycine. Les ionophores induisent l’efflux d’ions potassique, activant et oligomérisant les protéines NLRP3. La NLRP3 oligomérisée recrute des protéines adaptatrices, facilitant la liaison de la pro-caspase-1, formant le complexe inflammasome NLRP3.

Sur l’inflammasome, la proximité déclenche l’auto-clivage de la pro-caspase-1, libérant des caspases actives, initiant la pyroptose et la condensation nucléaire. De plus, la glycine stabilise la structure cellulaire, empêchant la lyse cellulaire.

Traitez les macrophages avec des sondes rapporteures fluorescentes contenant un groupe de liaison caspase-1 et un fluorophore lié par une séquence d’acides aminés. La caspase-1 activée reconnaît la séquence d’acides aminés de la sonde et se lie à son groupe de liaison à la caspase, ce qui permet sa visualisation.

Fixez les cellules et recouvrez-les d’un colorant fluorescent pour colorer les noyaux. Image sous microscope à fluorescence.

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