Une technique in vitro pour étudier la formation du complexe inflammasome dans les macrophages

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Immunologie

0 vues • 3:06 min • July 8th, 2025

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Commencez par une plaque contenant une culture de macrophages primaires.

Introduire le lipopolysaccharide bactérien, LPS, qui se lie aux récepteurs de type Toll sur les macrophages, déclenchant la régulation positive de la protéine NLR de la famille des pyrines contenant 3 ou NLRP3.

Ajoutez un ionophore qui médie l’efflux d’ions potassium. La diminution du potassium cytosolique active NLRP3. NLRP3 activée oligomérise et induit le recrutement d’une protéine adaptatrice, qui à son tour recrute la pro-caspase-1, formant un inflammasome.

L’auto-protéolyse convertit la pro-caspase-1 en caspase-1 active, qui médie la mort cellulaire inflammatoire ou la pyroptose. Les dommages à l’ADN pendant la pyroptose entraînent la condensation nucléaire.

Fixez les cellules et traitez-les avec un détergent pour les perméabiliser.

Ajoutez un anticorps primaire se liant à la protéine adaptatrice associée à l’inflammasome, et un anticorps secondaire marqué par fluorescence qui se lie à l’anticorps primaire, marquant l’inflammasome.

Introduisez une coloration fluorescente à l’acide nucléique pour marquer le noyau. Sous un microscope à fluorescence, les cellules présentent des noyaux condensés – indiquant une pyroptose – et des foyers de protéines adaptatrices – indiquant la formation d’inflammasomes.

Pour l’analyse immunofluorochimique des cellules traitées à la nigéricine, laver les cellules marquées à la sonde et incuber les cellules dans 250 microlitres de solution de fixation et de perméabilisation par puits pendant 30 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière.

Lavez les macrophages trois fois de plus avec un tampon de lavage frais et étiquetez les cellules avec 250 microlitres d’anticorps primaires contre la protéine speck-like associée à l’apoptose contenant un domaine de recrutement de caspase C-terminal, ou ASC, par puits pendant une heure sur glace.

Lavez les cellules à la fin de l’incubation et étiquetez les échantillons avec 250 microlitres de l’anticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent approprié pendant une autre heure sur de la glace, en ajoutant 4 microlitres d’un colorant nucléaire fluorescent approprié pendant les 5 dernières minutes.

Après avoir lavé les cellules 3 fois dans un tampon de lavage à froid, montez des lamelles sur les lames avec 7 microlitres de milieu de montage anti-décoloration comme démontré, et imagez les macrophages par microscopie confocale à fluorescence.

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Dernière mise à jour : 1 août 2026