Une technique in vitro pour étudier la formation du complexe inflammasome dans les macrophages
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 3:06 min • July 8th, 2025
Commencez par une plaque contenant une culture de macrophages primaires.
Introduire le lipopolysaccharide bactérien, LPS, qui se lie aux récepteurs de type Toll sur les macrophages, déclenchant la régulation positive de la protéine NLR de la famille des pyrines contenant 3 ou NLRP3.
Ajoutez un ionophore qui médie l’efflux d’ions potassium. La diminution du potassium cytosolique active NLRP3. NLRP3 activée oligomérise et induit le recrutement d’une protéine adaptatrice, qui à son tour recrute la pro-caspase-1, formant un inflammasome.
L’auto-protéolyse convertit la pro-caspase-1 en caspase-1 active, qui médie la mort cellulaire inflammatoire ou la pyroptose. Les dommages à l’ADN pendant la pyroptose entraînent la condensation nucléaire.
Fixez les cellules et traitez-les avec un détergent pour les perméabiliser.
Ajoutez un anticorps primaire se liant à la protéine adaptatrice associée à l’inflammasome, et un anticorps secondaire marqué par fluorescence qui se lie à l’anticorps primaire, marquant l’inflammasome.
Introduisez une coloration fluorescente à l’acide nucléique pour marquer le noyau. Sous un microscope à fluorescence, les cellules présentent des noyaux condensés – indiquant une pyroptose – et des foyers de protéines adaptatrices – indiquant la formation d’inflammasomes.
Pour l’analyse immunofluorochimique des cellules traitées à la nigéricine, laver les cellules marquées à la sonde et incuber les cellules dans 250 microlitres de solution de fixation et de perméabilisation par puits pendant 30 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière.
Lavez les macrophages trois fois de plus avec un tampon de lavage frais et étiquetez les cellules avec 250 microlitres d’anticorps primaires contre la protéine speck-like associée à l’apoptose contenant un domaine de recrutement de caspase C-terminal, ou ASC, par puits pendant une heure sur glace.
Lavez les cellules à la fin de l’incubation et étiquetez les échantillons avec 250 microlitres de l’anticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent approprié pendant une autre heure sur de la glace, en ajoutant 4 microlitres d’un colorant nucléaire fluorescent approprié pendant les 5 dernières minutes.
Après avoir lavé les cellules 3 fois dans un tampon de lavage à froid, montez des lamelles sur les lames avec 7 microlitres de milieu de montage anti-décoloration comme démontré, et imagez les macrophages par microscopie confocale à fluorescence.
Aperçu
Cet article décrit un protocole permettant d'étudier l'activation de l'inflammasome NLRP3 dans des macrophages primaires. Le processus implique l'introduction de lipopolysaccharide bactérien et des traitements ultérieurs afin de visualiser la formation de l'inflammasome et la pyroptose par microscopie de fluorescence.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Biologie cellulaire
- Recherche sur l'inflammation
Contexte
- L'inflammasome NLRP3 joue un rôle essentiel dans la réponse immunitaire.
- L'activation de NLRP3 est associée à diverses maladies inflammatoires.
- Comprendre son activation peut fournir des informations sur les cibles thérapeutiques.
- La microscopie à fluorescence est un outil puissant pour visualiser les processus cellulaires.
Objectif de l'étude
- Élucider le mécanisme d'activation de l'inflammasome NLRP3.
- Montrer l'utilisation de la microscopie à fluorescence pour l'étude de la pyroptose.
- Fournir un protocole détaillé aux chercheurs du domaine.
Méthodes utilisées
- Culture de macrophages primaires.
- Introduction de LPS pour activer les récepteurs de type Toll.
- Utilisation d'un ionophore pour induire l'efflux de potassium.
- Coloration en immunofluorescence pour visualiser les composants de l'inflammasome.
Résultats principaux
- Activation réussie de la NLRP3 et formation de l'inflammasome.
- Visualisation de noyaux condensés indiquant la pyroptose.
- Identification des protéines adaptatrices associées à la formation de l'inflammasome.
- Démonstration de l'efficacité du protocole pour l'étude des réponses des macrophages.
Conclusions
- L'étude fournit une méthodologie claire pour l'investigation de l'activation de l'inflammasome.
- Les résultats contribuent à la compréhension des processus inflammatoires dans les macrophages.
- Cette approche peut être appliquée à d'autres études des réponses immunitaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La visualisation directe de l'assemblage de l'inflammasome NLRP3 dans les macrophages primaires permet une détection mécanistique des risques lors de l'étape de validation ciblée pour la découverte de médicaments orientés vers l'inflammation. Des lectures quantitatives par immunofluorescence renforcent la confiance prédictive dans l'implication du chemin de signalisation et facilitent le tri précoce des cibles candidates impliquées dans la signalisation immunitaire innée. Ce flux de travail renforce la continuité translationnelle entre la biologie de découverte et le choix des modèles précliniques dans les portefeuilles d'immunologie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'interrogation directe de l'activation de NLRP3 et de la formation du complexe dans les macrophages pertinents pour la maladie.
- Contribue à l'atténuation des risques biologiques en confirmant l'engagement de la voie au niveau du complexe protéique.
- Fournit des preuves visuelles et quantitatives de la validation fonctionnelle de la cible.
- Facilite une confiance prédictive dans la modulation des voies immunitaires innées.
Élaboration de tests et criblage
- Établit un dosage d'immunofluorescence validé pour la détection de l'assemblage de l'inflammasome.
- Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs pour les flux de travail de criblage en aval.
- Permet la standardisation et l'évolutivité du dosage pour l'évaluation de composés ciblant NLRP3.
- Permet une détection fiable de l'activation de la voie et des phénotypes de mort cellulaire.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats in vitro avec les mécanismes immunitaires pertinents pour la maladie, afin de développer des biomarqueurs translationnels.
- Assure une continuité allant de l'analyse des voies cellulaires à la sélection de modèles précliniques.
- Appuie les décisions d'avancement ajustées au risque pour les programmes ciblant l'inflammation.
- Offre une déminution du risque de nature mécanistique lors du choix des candidats dans les séries de développement en immunologie.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode basée sur l'immunofluorescence s'intègre dans le continuum de découverte, depuis le test initial d'hypothèses jusqu'à l'identification des candidats et la validation préclinique pour les cibles de l'immunité innée.
- Découverte biologique : Confirme l'activation de la voie NLRP3 et l'assemblage de l'inflammasome dans les macrophages primaires.
- Écranage : Fournit des lectures quantitatives et reproductibles pour le développement de tests et l'écranage de composés.
- Analytique : Permet la mesure des foyers de protéines adaptatrices et de la condensation nucléaire comme paramètres fonctionnels.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre l'analyse de la voie in vitro et le choix de modèles immunitaires précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme réutilisable pour évaluer les interventions ciblant l'inflammasome dans divers programmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles d'immunofluorescence standardisés, évolutifs et reproductibles.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon et l'efficacité du capital en clarifiant précocement l'engagement des voies.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et un développement adaptés au risque des actifs ciblant l'inflammation.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de macrophages primaires et en microscopie en immunofluorescence.
- Suppose l'accès à une imagerie confocale et à des réactifs d'anticorps validés pour la détection de l'ASC.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de marquage et d'imagerie afin d'assurer la reproductibilité.
- Pourrait nécessiter des adaptations selon les sources de macrophages ou les modèles de maladie.
- Dépend d'une quantification rigoureuse de la condensation nucléaire et des foyers protéiques comme paramètres de sortie.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Illuminant les voies à l’Activation des caspases utilisant la Fluorescence bimoléculaire complémentation
Vidéos connexes
0 Vues
Visualisation de la proximité induite par les caspases inflammatoires dans les macrophages dérivés des monocytes humains
Vidéos connexes
0 Vues
Évaluation de l’activation des caspases pour évaluer la mort des cellules immunitaires innées
Vidéos connexes
0 Vues
Visualisation de l’activation de la caspase dans des macrophages dérivés de monocytes humains
Vidéos connexes
0 Vues
Détection de l’activation de l’inflammasome par microscopie à fluorescence
Vidéos connexes
0 Vues
Évaluation de l’activation de plusieurs caspases dans les macrophages
Vidéos connexes
0 Vues
Activation et évaluation de NLRP3 Inflammasome activité de l'IL-1β Utilisation dans des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes
Vidéos connexes
0 Vues
En utilisant l'ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris
Vidéos connexes
0 Vues
La transfection très efficace des droits de THP-1 par les macrophages nucléofection
Vidéos connexes
0 Vues
"Phagosome Clôture Assay" pour visualiser Formation Phagosome en trois dimensions en utilisant la réflexion interne totale Fluorescent Microscopy (TIRFM)
Vidéos connexes
0 Vues
Dernière mise à jour : 29 août 2026