Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
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Prenez une plaque de dosage contenant des macrophages amorcés avec du lipopolysaccharide.
L’amorçage augmente l’expression des précurseurs pro-inflammatoires inactifs des cytokines et des protéines NLRP3.
Ajoutez de la nigéricine, un ionophore de potassium, favorisant l’efflux d’ions. Cela perturbe les niveaux de potassium intracellulaires, déclenchant les protéines NLRP3, pour former un grand complexe.
L’oligomérisation NLRP3 recrute les protéines adaptatrices, ASC, provoquant leur polymérisation. Les filaments ASC recrutent la pro-caspase-1, formant l’inflammasome NLRP3, un complexe multiprotéique.
La pro-caspase-1 subit une auto-activation induite par la proximité, générant la caspase-1. La caspase-1 clive la cytokine pro-inflammatoire et la protéine gasdermine-D, créant ainsi un pore de membrane plasmique.
Cela entraîne la sécrétion de cytokines et la mort cellulaire programmée inflammatoire, la pyroptose, la libération de contenus intracellulaires, y compris la lactate déshydrogénase, ou LDH. Prélevez le surnageant contenant de la LDH.
Ajoutez un mélange de substrat - lactate, violet d’iodonitrozolium ou colorant INT, NAD+ et diaphorase. La LDH oxyde le lactate en pyruvate tout en réduisant le NAD+. La diaphorase catalyse la réduction de l’INT, formant du formazan de couleur rouge.
L’intensité de la couleur correspond à la libération de LDH, avec des niveaux élevés indiquant une augmentation des dommages cellulaires et la mort associés à la pyroptose.
Pour effectuer un test de libération de LDH, ajoutez 50 microlitres de milieu DMEM-5 complété par 10 micromolaires de nigéricine dans chaque puits expérimental, et 50 microlitres de DMEM-5 dans les puits de contrôle spontanés et 100 % de lyse pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après 30 minutes, ajoutez 10 microlitres de tampon de lyse 10x dans les puits de contrôle de lyse à 100 %, et ajoutez 10 microlitres de milieu dans les autres puits. À la fin de l’incubation, centrifugez la plaque et transférez 50 microlitres de surnageant de chaque puits dans une plaque transparente à fond plat.
Ensuite, ajoutez 50 microlitres de substrat fraîchement décongelé et préparé dans chaque puits pour une incubation de 30 minutes dans l’obscurité, en vérifiant la plaque après 15 minutes pour confirmer que le signal ne dépassera pas la limite de détection du lecteur de plaques. À la fin de l’incubation, ajoutez 50 microlitres de solution d’arrêt dans chaque puits et mesurez la DO490 sur un lecteur de plaque approprié pour permettre le calcul du pourcentage de lyse cellulaire par puits.