Isolement de lipides à partir de neutrophiles dérivés du sang humain par séparation biphasique

Prenez un tube de verre contenant un homogénat de neutrophiles avec des composants intracellulaires libérés.

Ajoutez du méthanol, un solvant polaire, qui perturbe les interactions lipides-lipides et lipides-protéines. La polarité inhérente au méthanol répartit uniformément les lipides polaires, en les solubilisant. Ensuite, ajoutez du chloroforme, un solvant organique non polaire, qui interagit avec les lipides non polaires, ce qui les disperse et se solubilise.

Centrifugeuse pour séparer la pastille contenant des protéines du surnageant contenant des lipides, des polysaccharides et des débris cellulaires. Transférez le surnageant dans un tube en verre frais. Ajouter le chloroforme et l’eau distillée. Centrifugez l’échantillon.

L’ajout d’eau forme spontanément un système biphasique, répartissant les biomolécules dans les couches inférieures de chloroforme et les couches supérieures d’eau-méthanol.

La couche de chloroforme comprend des lipides non polaires dissous, tandis que la couche supérieure contient des contaminants non lipidiques et davantage de lipides polaires. Retirez la couche supérieure d’eau-méthanol sans perturber la couche contenant des lipides.

Utilisez un concentrateur sous vide pour éliminer le solvant des lipides. Conserver à des températures plus basses jusqu’à nouvel ordre.

Pour isoler les lipides des neutrophiles dérivés du sang périphérique humain, prenez les neutrophiles préparés et placez-les sur de la glace. Pipetez les neutrophiles dans un tube en verre à bouchon à vis de 15 millilitres avec un joint en PTFE, et homogénéisez-les en les agitant pendant une minute. Ensuite, ajoutez 2 millilitres de méthanol, suivis une minute plus tard de 1 millilitre de chloroforme. Après avoir secoué pendant encore une minute, faites pivoter les tubes de verre à température ambiante et à 50 tr/min pendant 30 minutes.

Ensuite, granulez la fraction protéique en centrifugeant la solution à 7 degrés Celsius et 1952 fois g pendant 10 minutes. Décanter soigneusement le surnageant dans un nouveau tube à bouchon à vis en verre de 15 millilitres en laissant la pastille contenant des protéines derrière elle. Conservez la pastille à moins 20 degrés Celsius pour une quantification future.

Ajouter 1 millilitre de chloroforme et attendre une minute. Ensuite, ajoutez 1 millilitre d’eau distillée double et retournez le tube à bouchon à vis en verre avec l’échantillon pendant 30 secondes. Après avoir centrifugé l’échantillon comme précédemment, retirez et jetez la phase supérieure jusqu’à la couche trouble, à l’exclusion de celle-ci. Séchez les échantillons dans un concentrateur sous vide à 60 degrés Celsius et stockez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin.