Un test de libération de lactate déshydrogénase pour détecter l’infection à Cryptococcus neoformans dans les macrophages

Prenez une plaque multi-puits contenant des macrophages.

Ajouter Cryptococcus neoformans aux puits d’essai, tandis que les puits de contrôle ne contiennent que des macrophages.

Les macrophages phagocytent les champignons à l’intérieur des phagosomes.

Laver avec un tampon pour éliminer les champignons non phagocytés. Ajouter un milieu sans antibiotiques. Couver.

Le phagosome fusionne avec le lysosome, formant un phagolysosome. Les champignons modulent le pH des phagolysosomes et possèdent des mécanismes intrinsèques pour survivre aux conditions difficiles du phagolysosome. Les champignons perméabilisent la membrane phagolysosomale et se répliquent, accompagnés d’une accumulation cytosolique de vésicules remplies de polysaccharides.

La résidence et la réplication fongiques intracellulaires causent des dommages cellulaires, déclenchant des voies de mort cellulaire. Cela provoque la lyse des macrophages et la libération de contenu intracellulaire, y compris la lactate déshydrogénase ou LDH, dans les milieux.

Collectez des supports contenant de la LDH à différents moments. Lyser les macrophages de contrôle à des points de temps similaires pour une libération cellulaire maximale de LDH. Ajouter le mélange de dosage au milieu collecté et aux lysats. La LDH convertit le lactate en pyruvate, réduisant ainsi le NAD⁺. La diaphorase réduit le sel de tétrazolium, formant un produit de formazan rouge.

À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurer l’absorbance du formazan pour quantifier la lyse des macrophages après une infection à Cryptococcus neoformans.

Pour préparer les cellules fongiques à une infection par les macrophages, prélever et centrifuger des cellules de C. neoformans à partir d’une culture en phase mi-logarithmique, suivie de trois lavages doux avec 1 millilitre de PBS à température ambiante dans les mêmes conditions de centrifugation.

Après le dernier lavage, remettez les cellules fongiques en suspension à raison de 1,2 fois 10 à 80 cellules par millilitre, de concentration de milieu de culture cellulaire sans antibiotique, et ajoutez 1 millilitre de suspension de cellules fongiques dans chacun des 4 puits d’une plaque de culture de macrophages à 6 puits confluents à 70 % à 80 %. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois heures. Inclinez soigneusement la plaque pour permettre à chaque puits d’être lavé doucement trois fois avec 1 millilitre de PBS par puits et par lavage.

Pour mesurer la compétence de l’infection après le dernier lavage, ajoutez 1 millilitre de milieu sans antibiotique dans chaque puits de la plaque à 6 puits et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Aux points expérimentaux appropriés, prélever le surnageant de chaque puits et mesurer la quantité de LDH dans chaque puits conformément aux protocoles standard. Aux mêmes points, lysez les cellules macrophages non infectées pour déterminer la valeur de cytotoxicité maximale.

La cytotoxicité peut ensuite être calculée à l’aide de la formule indiquée.