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Prenez un système d’infection à deux chambres séparées par une membrane perméable. Le compartiment inférieur contient des kératinocytes humains adhérents, ou cellules cutanées.
Ajoutez des bactéries pathogènes dans la chambre supérieure et incubez. La membrane empêche le contact direct des agents pathogènes avec les kératinocytes. Les agents pathogènes sécrètent de la streptolysine S ou SLS – une petite toxine – qui traverse la membrane pour atteindre les cellules.
Le cotransporteur du bicarbonate de sodium sur les kératinocytes médie l’afflux de bicarbonate et d’ions sodium, maintenant le pH intracellulaire. Le SLS se lie au cotransporteur et perturbe le transport des ions, entraînant un stress osmotique intracellulaire.
La signalisation en aval induite par le stress provoque la dégradation de l’inhibiteur lié au facteur nucléaire-Kappa B séquestré, ou NF-κB, conduisant à son activation. Le NF-κB activé se déplace vers le noyau, ce qui entraîne la régulation positive de la production de cytokines pro-inflammatoires.
Lors de la sécrétion extracellulaire, les cytokines se lient aux récepteurs de mort de la cellule hôte, initiant la nécrose. Après l’incubation, prélever le surnageant de culture pour évaluer l’impact de la toxine bactérienne.
Immédiatement avant le traitement, utilisez 1X PBS pour laver les cellules. Ensuite, appliquez 2 millilitres de milieu de croissance frais avec ou sans traitement pharmacologique sur les plaques à six puits, ou 0,5 millilitre de milieu sur les puits des plaques à 24 puits. Ensuite, sous une hotte à flux laminaire, utilisez une pince stérile pour placer soigneusement une membrane perméable stérile de 0,4 micron dans chaque puits.
Une manipulation douce et stérile des inserts perméables pendant la préparation de l’infection est essentielle pour éviter que la membrane ne soit compromise ou contaminée au cours de ce processus.
Appliquez un milieu de culture cellulaire frais dans la chambre supérieure de chaque puits, selon les instructions du fabricant. Ensuite, appliquez un volume approprié de cultures bactériennes normalisées dans la chambre supérieure du système d’insertion de membrane perméable et appliquez un milieu bactérien dans les puits de contrôle.
L’ajout soigneux des bactéries dans la chambre supérieure, ainsi que le transport en douceur des cellules infectées vers l’incubateur, sont essentiels, car il est essentiel que les bactéries ne contaminent pas la chambre inférieure pendant la configuration expérimentale.
Pour évaluer la présence de protéines de l’hôte sécrétées, utilisez une pince stérile pour retirer soigneusement l’insert de membrane perméable. Ensuite, sans perturber la monocouche de cellules, collectez le milieu de la chambre inférieure dans des tubes de 1,5 millilitre.
Centrifugez les échantillons à 14 000 RCF et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes pour granuler les débris cellulaires. Ensuite, retirez tous les microlitres sauf 50 microlitres de surnageant, transférez-les dans un tube frais de 1,5 millilitre et conservez-le à moins 20 degrés Celsius, ou utilisez-le immédiatement.