Extraction du lysat de cellules hôtes à partir de cellules hôtes infectées cultivées dans un système membranaire perméable

Commencez par ensemencer des cellules hôtes de mammifères dans le compartiment inférieur d’un système membranaire perméable.

Ajoutez Streptococcus - une bactérie pathogène connue pour sécréter la toxine streptolysine S ou SLS, à l’insert de la membrane. La toxine SLS se diffuse à travers le pore de la membrane et atteint la cellule hôte.

Les cotransporteurs membranaires de bicarbonate de sodium régulent le transport des ions, maintenant l’homéostasie cellulaire. La toxine se lie à ces cotransporteurs, perturbant le transport des ions et provoquant un stress osmotique dans les cellules hôtes.

Cela active plusieurs cascades de signalisation en aval, y compris p38 MAPK, une voie de protéine kinase activée par les mitogènes. Activé p38 MAPK phosphoryle ses cibles en aval, initiant une réponse cellulaire contre les bactéries.

Ensuite, retirez l’insert de membrane perméable. Aspirez le milieu au-dessus des cellules hôtes. Ajoutez un tampon de lyse pour libérer le contenu cellulaire. Centrifugeuse pour granuler les débris de la cellule.

Prélever le surnageant contenant des composants solubles du lysat et la pastille contenant des composants insolubles du lysat. Conservez les échantillons pour une analyse plus approfondie.

Immédiatement avant le traitement, utilisez 1X PBS pour laver les cellules. Ensuite, appliquez 2 millilitres de milieu de croissance frais avec ou sans traitement pharmacologique sur les plaques à six puits, ou 0,5 millilitre de milieu sur les puits des plaques à 24 puits. Ensuite, sous une hotte à flux laminaire, utilisez une pince stérile pour placer soigneusement un insert de membrane perméable stérile de 0,4 micron dans chaque puits.

Une manipulation douce et stérile des inserts perméables pendant la préparation de l’infection est essentielle pour éviter que la membrane ne soit compromise ou contaminée au cours de ce processus.

Appliquez du milieu de culture cellulaire frais dans la chambre supérieure de chaque puits selon les instructions du fabricant. Ensuite, appliquez un volume approprié de cultures bactériennes normalisées dans la chambre supérieure du système d’insertion de membrane perméable et appliquez un milieu bactérien dans les puits de contrôle.

L’ajout soigneux des bactéries dans la chambre supérieure, ainsi que le transport en douceur des cellules infectées vers l’incubateur, sont essentiels, car il est essentiel que les bactéries ne contaminent pas la chambre inférieure pendant la configuration expérimentale.

À l’aide d’une pince stérile, retirez soigneusement l’insert de membrane perméable.

Pour l’évaluation des lysats de cellules hôtes, aspirez doucement le milieu au-dessus de la monocouche sans perturber les cellules hôtes. Ensuite, utilisez du PBS pour rincer les cellules une fois. Aspirez doucement le PBS et appliquez immédiatement un volume de tampon de lyse glacé pour obtenir, par exemple, une concentration en protéines de 0,5 à 1,5 milligramme par millilitre. Ensuite, incubez les échantillons sur de la glace pendant 15 minutes.

Ensuite, utilisez un grattoir pour détacher les cellules de la surface de la plaque de chaque puits et transférez tout le contenu de chaque puits dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez les échantillons à 14 000 RCF et 4 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Pour évaluer les composants solubles du lysat, transférez le surnageant dans un tube frais et conservez-le à moins 20 degrés Celsius, ou utilisez-le immédiatement. Pour évaluer les composants nucléaires ou d’autres composants de lysat insoluble, réservez la pastille et stockez-la à moins 20 degrés Celsius, ou utilisez-la immédiatement.